Visualisera clathrin medierad endocytos av G-proteinkopplade receptorer på Single-event upplösning via TIRF Mikroskopi
Summary
Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Abstract
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
Introduction
Processen att clathrin medierad endocytos (CME) är beroende av läglig ankomst av de många komponenterna i clathrin medierad endocytiska maskiner för att samla last och manipulera plasmamembranet i vesiklarna 1-3. CME initieras av membran deformerar och last adaptorproteiner som kommer tillsammans vid begynnande platser av endocytos 1. Dessa proteiner rekrytera pälsen protein clathrin, som sätter ihop i en bur-liknande struktur som bildar clathrin belagda grop (KKP) 4. När KKP är helt monteras till en sfärisk form, membran splittring, främst genom åtgärder av det stora GTPase, dynamin, genererar fria clathrin belagda vesiklar (CCVS) 5,6. Denna interna utlöser en snabb demontering av clathrin päls, vilket gör komponenter som ska återanvändas för flera omgångar av CME.
Upptäckten och karakterisering av de proteiner som är involverade i CME har sina rötter i traditionell Biochemical, genetiska och mikroskopitekniker 4-6,8. Dessa analyser har klar roller och interaktionspunkter dessa endocytic komponenter. Även mycket användbart för att definiera viktiga komponenter för människohandel maskiner, är dessa analyser starkt begränsad i att fånga det dynamiska beteendet hos CME komponenter eller last koncentration. Detta är en kritisk begränsning, eftersom CME drivs av koreograferad montering av uppsättningar av protein moduler i definierade steg, och eftersom små förändringar i dynamiken i enskilda endocytic händelser kan få stora kumulativa konsekvenser för endocytos. Vidare senaste uppgifterna tyder på att enskilda centrala motparter kan skilja både sammansättning och beteende, vilket tyder på att den fysiologiska regleringen av denna process är mycket rumsligt och tidsmässigt begränsade 9-14. Visualisera enskilda endocytic händelser är därför viktigt att förstå varför det finns flera redundanta proteiner involverade i CME och hur dessa proteiner kan styras by fysiologiska signaler för att reglera last intemalisering.
Här beskriver vi användningen av total intern reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM) att observera CME på nivån för dynamiken i enskilda centrala motparter i levande celler. TIRFM förlitar sig på skillnaden i brytningsindex mellan glastäckglas och den vätskemiljö av celler 15,16. När excitationsljus riktas mot cellerna vid mer än den kritiska vinkeln, det reflekteras internt, vilket skapar en evanescent våg som upprätthåller ett tunt område av belysning sträcker sig ungefär 100 nm ovanför täckglas. Detta säkerställer att endast de fluorescerande molekyler inom denna smala område är glada. Praktiskt, medger detta att excitation av fluorescerande molekyler på eller nära plasmamembranet, och minimerar fluorescens från de inre delarna av cellen. Detta tillhandahåller ett signifikant högre signal-till-brusförhållande och z-axeln upplösning för att visualisera händelser på plasmamembranet, compared till mer vanligen använda lägen som konventionell epifluorescens eller konfokal fluorescensmikroskopi. Vi beskriver också, till introduktions och praktisk nivå, till användning av ett vanligt förekommande bildanalysplattform analysera och kvantifiera enkla morfologiska egenskaper och dynamik enskilda last endocytic händelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi användandet av TIRFM att visualisera clathrin medierad endocytos (CME) på nivån för enskilda centrala motparter i levande celler i realtid. CME är en snabb och mycket dynamisk händelse förmedlas av den ackumulerade effekten av många rumsligt och tidsmässigt separata enskilda händelser. De flesta analyser som för närvarande används, såsom biokemiska mätningar av interna använder ytan biotinylering eller ligand bindande, flödescytometri eller fasta celler analyser som mäter mängden int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
