Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF
Summary
Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Abstract
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
Introduction
Il processo di endocitosi clatrina-mediata (CME) dipende l'arrivo tempestivo delle tante componenti del macchinario endocitosi clatrina-mediata per raccogliere il carico e manipolare la membrana plasmatica in vescicole 1-3. CME è avviata da membrana deformazione e di carico-adattatore proteine che si uniscono in siti nascenti di endocitosi 1. Queste proteine reclutano la clatrina proteina di rivestimento, che assembla in una struttura a gabbia che forma la fossa clatrina rivestite (CCP) 4. Una volta che il PCC è completamente assemblato in una forma sferica, membrana scissione, soprattutto attraverso l'azione del grande GTPasi, dynamin, genera vescicole libere clatrina rivestite (CCV) 5,6. Questa interiorizzazione innesca un rapido smontaggio del mantello clatrina, permettendo componenti di essere riutilizzati per più cicli di CME.
La scoperta e la caratterizzazione delle proteine coinvolte nella CME è stata radicata nella Bioch tradizionaleemical, e le tecniche di microscopia genetiche 4-6,8. Questi test hanno chiarito i ruoli e punti di interazione di questi componenti endocitiche. Anche se molto utile per definire i componenti essenziali di macchinari traffico, questi test sono molto limitati a catturare il comportamento dinamico dei componenti CME o concentrazione del carico. Questa è una limitazione fondamentale, dal momento che CME è guidato dalla assemblea coreografia di serie di moduli proteici in passi definiti, e dal momento che i piccoli cambiamenti nelle dinamiche dei singoli eventi endocitiche può avere grandi conseguenze cumulative di endocitosi. Inoltre, dati recenti indicano che le singole controparti centrali possono differire sia nella composizione e nel comportamento, suggerendo che la regolazione fisiologica di questo processo è altamente spazialmente e temporalmente vincolato 9-14. Visualizzare singoli eventi endocitiche, dunque, è essenziale per capire il motivo per cui ci sono più proteine ridondanti coinvolte nel CME e b come queste proteine possano essere controllatisegnali fisiologici y per regolare il carico internalizzazione.
Qui si descrive l'uso di Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) per osservare CME a livello della dinamica dei singoli CCP in cellule viventi. TIRFM si basa sulla differenza di indice di rifrazione tra il vetrino di vetro e l'ambiente fluido di cellule 15,16. Quando la luce di eccitazione è diretto verso le cellule in oltre l'angolo critico, si riflette internamente, creando un'onda evanescente che mantiene un campo sottile di illuminazione che si estende a circa 100 nm sopra il vetrino. Questo assicura che solo le molecole fluorescenti all'interno di questo ristretto campo sono entusiasti. In pratica, questo permette l'eccitazione di molecole fluorescenti sopra o vicino alla membrana plasmatica, e riduce al minimo la fluorescenza dalle parti interne della cellula. Ciò fornisce un rapporto segnale-rumore e asse z risoluzione significativamente superiore per visualizzare gli eventi alla membrana plasmatica, compared a modi di trasporto più comunemente utilizzati, come epifluorescenza convenzionale o microscopia a fluorescenza confocale. Abbiamo anche descrivono, ad un livello introduttivo e pratico, l'uso di un'immagine piattaforma di analisi comunemente usato per analizzare e quantizzare semplici caratteristiche morfologiche e dinamiche dei singoli eventi cargo endocitiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive l'uso di TIRFM per visualizzare clatrina-mediata endocitosi (CME), a livello di singole controparti centrali in cellule viventi in tempo reale. CME è un evento rapido e altamente dinamico mediato dall'effetto cumulativo di molti spazialmente e temporalmente separati singoli eventi. La maggior parte dei test che sono attualmente utilizzati, come le misurazioni biochimiche di interiorizzazione con biotinilazione superficie o di legame ligando, citometria a flusso o cellule dosaggi fissi di misura …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
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