TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme
Summary
Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Abstract
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
Introduction
Klatrin aracılı endositoz (STE) gibi bir işlem vezikülleri içine 1-3 kargo toplamak ve plazma membranını işlemek için klatrin aracılı endositik makine birçok bileşenden iyi zamanlanmış girişte bağlıdır. CME endositozun 1 doğmakta sitelerinde bir araya gelip zar deforme ve kargo-adaptör proteinler tarafından başlatılır. Bu proteinler, klatrin kaplı çukur (CCP) 4 meydana getiren bir kafes benzeri bir yapı halinde birleşmektedir örtü proteini klatrin, işe. CCP tamamen esas olarak büyük GTPaz, Dynamin etki ile küresel şekil, membran kesimleri, içine monte edildiğinde, serbest klatrin kaplı vezikülleri (CCVS 5,6) oluşturur. Bu içselleştirme bileşenleri CME sanmı için yeniden kullanılmasına izin, klatrin kat hızlı sökme tetikler.
CME katılan proteinlerin keşfi ve karakterizasyonu geleneksel Bioch köklü olmuşturemical, genetik ve mikroskopi teknikleri 4-6,8. Bu deneyler, bu endositik bileşenlerin rolleri ve etkileşim noktaları aydınlatmıştır. Ticareti makine temel bileşenleri tanımlamak için yararlı olmakla birlikte, bu deneyler, yüksek STE bileşenleri veya yük konsantrasyon dinamik davranışını yakalama sınırlıdır. CME tanımlanan adımda protein modüllerin setleri koreografisini meclisi tarafından tahrik edilir çünkü bu, kritik bir sınırlama olduğunu ve bireysel endositik olayların dinamikleri küçük değişiklikler endositoz ile ilgili geniş bir kümülatif sonuçlar doğurabilir beri. Bundan başka, son veriler, ayrı ayrı KDN bu sürecin fizyolojik düzenleme yüksek uzamsal ve zamansal olarak kısıtlı 9-14 düşündüren, bileşim içinde ve davranış bakımından farklılık olabileceğini göstermektedir. Bireysel endositik olayları görselleştirmek, bu nedenle, CME katılan bir çok gereksiz proteinler ve nasıl bu proteinler kontrol edilebilir b var neden anlamak esastıry fizyolojik sinyaller kargo içselleşmesini düzenler.
Burada canlı hücrelerin içindeki bireysel CCP dinamiklerinin düzeyinde CME gözlemlemek için Toplam İç Yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) kullanımını tarif etmektedir. TIRFM cam lamel ve hücrelerin 15,16 sıvı ortam arasındaki kırılma indeksi arasındaki farka dayanır. Uyarım ışığı önemli açıdan daha hücrelere doğru yönlendirilir, bu dahili lamel yaklaşık 100 nm olarak uzanan bir aydınlatma alanını koruyan ince bir genliği azalan bir dalga oluşturulması, yansıtılır. Bu, bu dar alan içinde sadece floresan moleküller heyecanlı olmasını sağlar. Pratik olarak bu ya da plazma zarının yakın fluoresan moleküller uyarılmasını sağlar ve hücrenin iç kısımlarından floresans en aza indirir. Bu plazma zarı, co olayları görselleştirmek için önemli ölçüde daha yüksek sinyal-gürültü oranı ve z ekseni çözünürlüğü sağlarBu tür geleneksel epifluoresan veya konfokal floresan mikroskopisi gibi daha yaygın kullanılan modlara mpared. Biz de bir tanıtıcı ve pratik düzeyde tanımlamak, yaygın olarak kullanılan bir görüntü analizi platformunun kullanımı analiz ve basit morfolojik özellikleri ve bireysel kargo endositik olayların dinamiklerini ölçmek için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, gerçek zamanlı olarak canlı hücreler bireysel CCP düzeyinde klatrin aracılı endositoz (STE) görselleştirmek için TIRFM kullanımını tarif eder. CME birçok mekansal ve zamansal ayrı münferit olayların kümülatif etkinin aracılığı hızlı ve son derece dinamik bir olaydır. Bu içselleştirme biyokimyasal ölçümleri olarak şu anda kullanılan çoğu deneyleri, yüzey biyotinilasyonunu veya bağlayıcı ligandı, akış sitometri veya içselleştirilmiş proteinler, ya da proteinlerin elektr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
