TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化
Summary
Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Abstract
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
Introduction
クラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）の過程は、小胞1-3に貨物を収集し、原形質膜を操作するクラスリン媒介エンドサイトーシス機構の多くのコンポーネントの時宜を得た到着時に依存している。 CMEは、膜が変形し、エンドサイトーシス1の発生期の現場で一緒になる貨物アダプタータンパク質によって開始されます。これらのタンパク質は、クラスリン被覆ピット（CCP）4を形成し 、かご状構造に組み立てるコートタンパク質クラスリンを募集。 CCPが完全に球状に組み立てられると、膜の切断は、主に大規模なGTPアーゼの作用を介して、ダイナミンは、無料のクラスリン被覆小胞（CCVS）5,6を生成します。この内在化は、コンポーネントが、CMEの複数のラウンドのために再利用することができるように、クラスリンコートの急激な分解をトリガします。
CMEに関与するタンパク質の発見および特徴は、伝統的なbiochに根付いてきたemical、遺伝的および顕微鏡技術4-6,8。これらのアッセイは、これらのエンドサイトーシスのコンポーネントの役割と相互作用点を解明した。売買機構の必須成分を定義するために非常に有用であるが、これらのアッセイは、高度CMEコンポーネントまたは貨物濃度の動的挙動を捉えることに限定されている。 CMEが定義されたステップにおけるタンパク質のモジュールのセットの振り付けアセンブリによって駆動されるので、これは重大な制限であり、そして個別のエンドサイトーシスイベントのダイナミクスの小さな変化は、エンドサイトーシスに大きな累積的な結果をもたらすことができるからである。さらに、最近のデータは、個別の清算機関がこのプロセスの生理学的調節が非常に空間的および時間的に9-14を拘束されていることを示唆している、組成物中にと行動の両方で異なる場合がありますことを示している。個別のエンドサイトーシス事象の可視化、したがって、複数の冗長CMEに関与するタンパク質とどのようにこれらのタンパク質は、Bを制御することかもしれないがある理由を理解することが不可欠であるyの生理学的信号は、貨物内在化を調節する。
ここでは、生きた細胞内の個別のCCPのダイナミクスのレベルでCMEを観測する全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の使用を記載している。 TIRFMは、カバーガラスとセル15,16の流体環境との間の屈折率の差に依存しています。励起光が臨界角以上で細胞に向けられるとき、それは内部カバースリップの上に、約100nmを拡張する照明の薄いフィールドを維持するエバネッセント波を作成し、反射される。これは、この狭いフィールド内の蛍光分子が励起されることを保証します。実際に、これは原形質膜上またはその近くの蛍光分子の励起を可能にし、細胞の内部部分からの蛍光を最小化する。これは、原形質膜、共同でイベントを視覚化するための有意に高い信号対雑音比、z軸の解像度を提供このような従来の落射蛍光または共焦点蛍光顕微鏡のようなより一般的に使用されるモードにmpared。また、入門、実用的なレベルで、個別の貨物エンドサイトーシスイベントの単純な形態学的特徴および動力学を分析し、定量するために一般に使用される画像解析プラットフォームの使用を記載している。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、リアルタイムで生きた細胞内の個別のCCPのレベルでクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）を可視化するTIRFMの使用を記載している。 CMEは、多くの空間的および時間的に独立した個別のイベントの累積効果により媒介される迅速かつ高ダイナミックなイベントです。そのような結合は、フローサイトメトリーまたは固定細胞アッセイは、内在化タンパク質の量、またはタンパ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
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