Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
Het proces van clathrine gemedieerde endocytose (CME) is afhankelijk van de tijdige aankomst van de vele componenten van de clathrine gemedieerde endocytotische machines lading verzamelen en manipuleren van het plasmamembraan in de vesicles 1-3. CME is een initiatief van membraan vervorming en vracht-adapter eiwitten die bij ontluikende locaties van endocytose 1 bij elkaar komen. Deze eiwitten werven de manteleiwitgen clathrin, die assembleert in een kooi-achtige structuur die de clathrin coated pit (CCP) 4 vormt. Zodra de CCP volledig is geassembleerd in een bolvorm, membraan splitsing, voornamelijk door middel van acties van de grote GTPase, dynamin, genereert free-clathrin gecoate blaasjes (CCV) 5,6. Deze internalisatie veroorzaakt snelle demontage van de clathrine laag, waardoor de componenten worden hergebruikt voor meerdere ronden van CME.
De ontdekking en karakterisering van de bij CME eiwitten is geworteld in de traditionele Biochemical, genetische en microscopische technieken 4-6,8. Deze testen zijn de rol en de interactie punten van deze endocytisch componenten toegelicht. Hoewel zeer nuttig voor het definiëren essentiële onderdelen van handel machines, zijn deze bepalingen zeer beperkt vastleggen van het dynamisch gedrag van CME onderdelen of lading concentratie. Dit is een kritieke beperking, aangezien CME wordt door de choreografie samenstellen van sets van proteïne modules in gedefinieerde stappen, en aangezien kleine veranderingen in de dynamiek van afzonderlijke gebeurtenissen endocytotische grote cumulatieve gevolgen endocytose hebben. Verder recente gegevens blijkt dat individuele CCP kunnen verschillen zowel in samenstelling als in gedrag, wat suggereert dat de fysiologische regulering van deze taak zeer ruimtelijk en temporeel beperkt 9-14. Visualiseren individuele endocytische gebeurtenissen is dus essentieel om te begrijpen waarom er meerdere redundante eiwitten betrokken bij CME en hoe deze eiwitten kunnen worden gecontroleerd by fysiologische signalen om vracht internalisatie reguleren.
Hier beschrijven we het gebruik van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) CME observeren op het niveau van de dynamiek van individuele CCP in levende cellen. TIRFM berust op het verschil in brekingsindex tussen de glazen dekglaasje en vloeibare omgeving cellen 15,16. Wanneer het excitatie licht naar de cellen op dan de kritische hoek, wordt intern gereflecteerd, waardoor een verdwijnende golf die een dunne gebied van verlichting zich ongeveer 100 nm boven het dekglaasje handhaaft. Dit zorgt ervoor dat alleen de fluorescerende moleculen binnen deze smalle veld zijn enthousiast. Praktisch, dit maakt de excitatie van fluorescerende moleculen op of nabij het plasmamembraan en minimaliseert fluorescentie van de inwendige delen van de cel. Dit verschaft een aanzienlijk hogere signaal-ruisverhouding en z-as resolutie gebeurtenissen in de plasmamembraan, co visualiserenmpared meer algemeen gebruikte modi zoals conventionele epifluorescentie of confocale fluorescentie microscopie. We beschrijven ook op een inleidend en praktijk, het gebruik van een algemeen gebruikte beeldanalyse platform te analyseren en kwantificeren eenvoudige morfologische kenmerken en dynamica van individuele lading endocytische events.
Hier beschrijven we het gebruik van TIRFM naar clathrine gemedieerde endocytose (CME) op het niveau van individuele CCP visualiseren in levende cellen in real time. CME is een snelle en zeer dynamische evenement gemedieerd door het cumulatieve effect van de vele ruimte en tijd gescheiden individuele gebeurtenissen. De meeste tests die momenteel worden gebruikt, zoals biochemische meting van opname middels oppervlak biotinylering of ligand binding, stroomcytometrie of gefixeerde cellen assays meten hoeveelheid geïnterna…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |