חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית
Summary
Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Abstract
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
Introduction
התהליך של אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) תלוי בהגעה מתוזמן היטב של מרכיבים הרבים של מכונות endocytic בתיווך clathrin לאסוף מטען ולתפעל את קרום הפלזמה לתוך שלפוחית 1-3. CME הוא ביוזמת חלבוני עיוות קרום ומטען מתאם שמגיעים יחד באתרים המתהווים של אנדוציטוזה 1. חלבונים אלה לגייס clathrin חלבון מעיל, אשר מרכיבה לתוך מבנה דמוי כלוב שיוצר את הבור מצופה clathrin (מק"ס) 4. ברגע שהמפלגה הקומוניסטית הסיני מורכב במלואו לצורה כדורית, scission קרום, בעיקר באמצעות פעולה של GTPase הגדול, dynamin, יוצר שלפוחית חופשית מצופה clathrin (CCVs) 5,6. הפנמה זו מעוררת פירוק מהיר של מעיל clathrin, המאפשר רכיבים לשימוש חוזר לסבבים רבים של CME.
הגילוי והאפיון של החלבונים המעורבים בCME כבר מושרשים בbioch המסורתיוטכניקות emical, גנטיות, מיקרוסקופיה 4-6,8. מבחני אלה הובהרו התפקידים ונקודות אינטראקציה של מרכיבי endocytic אלה. למרות שמאוד שימושי להגדרת מרכיבים חיוניים של מכונות סחר, מבחני אלה מוגבלים מאוד בלכידת ההתנהגות הדינמית של רכיבי CME או ריכוז מטען. זוהי מגבלה קריטית, שכן CME הוא מונע על ידי ההרכבה כוריאוגרפיה של קבוצות של מודולים חלבון בצעדים מוגדרים, וכן שינויים קטנים בדינמיקה של אירועי endocytic בודדים יכולים להיות השלכות מצטברות גדולות באנדוציטוזה. יתר על כן, הנתונים אחרונים מצביעים על כך שCCPs הבודד עשוי להיות שונה הן בהרכב ובהתנהגות, המצביעה על כך הרגולציה הפיזיולוגית של תהליך זה היא מאוד במרחב ובמוגבל 9-14 בזמן. לדמיין אירועי endocytic פרט, לכן, הוא חיוני כדי להבין מדוע יש חלבונים מרובים מיותרים מעורבים בCME וb איך אפשר לבקר את החלבונים האלהאותות פיסיולוגיים y להסדיר הפנמת מטען.
כאן אנו מתארים את השימוש בסך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM) להתבונן CME ברמה של הדינמיקה של CCPs הבודד בתאים חיים. TIRFM מסתמך על ההבדל במקדם שבירה בין coverslip הזכוכית וסביבת הנוזל של תאי 15,16. כאשר אור העירור מכוון לתאים של יותר מ הזווית הקריטית, זה בא לידי ביטוי באופן פנימי, יצירת גל חולף ששומר על שדה דק של תאורה המשתרע כ 100 ננומטר מעל coverslip. הדבר מבטיח כי מולקולות הניאון רק בתחום צר זה שמחים. למעשה, זה מאפשר העירור של מולקולות ניאון על או ליד קרום הפלזמה, וממזער את הקרינה מחלקי הפנים של התא. זה מספק רזולוציה יחס וציר z אות לרעש גבוהה באופן משמעותי כדי לחזות אירועים בקרום פלזמה, שיתוףmpared למצבים נפוצים יותר כגון epifluorescence הקונבנציונלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. אנו גם מתארים, במבוא וברמה מעשית, השימוש בפלטפורמת ניתוח תמונה נפוץ לנתח ולכמת תכונות מורפולוגיות פשוטות ודינמיקה של אירועי endocytic המטען אישיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים את השימוש בTIRFM לדמיין אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) ברמה של CCPs הבודד בתאים חיים בזמן אמת. CME הוא אירוע מהיר ודינמי מאוד מתווך על ידי ההשפעה המצטברת של אירועים בודדים רב מרחב ובזמן נפרד. רוב מבחני המשמשים כיום, כגון מדידות ביוכימיים של הפנמה באמצעות biotinylation מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
