العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية
Summary
We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Abstract
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Introduction
وقد اجتذبت الخلايا المشتقة من مصادر فترة ما حول الولادة، مثل المشيمة والأغشية المشيمية، الحبل السري والسائل الذي يحيط بالجنين الاهتمام من الباحثين والأطباء كمصدر محتمل للخلايا الطب التجديدي 1،2. والسبب في هذا الاهتمام هو أن هذه الأنواع من الخلايا كل تمتلك قدرا من المرونة والقدرة المناعية 3، الخصائص التي تعتبر أساسية لتطبيقات العلاجية المحتملة.
hAECs هي السكان الظهارية غير المتجانسة التي يمكن استخلاصها من مصطلح أو قبل الأجل السلى غشاء 4، وتوفير مصدر محتمل وفيرة من المواد الخلوية التجدد. الخصائص التي تجعل hAECs جذابة كعلاج الخلوي تتضمن multipotency بهم، وانخفاض المناعية، وخصائص مضادة للالتهابات. تم العثور على hAECs أن يكون متعدد القدرات العالية على حد سواء في التجارب المختبرية والحية، وقادرة على التفريق في الأنساب أرومية متوسطة (cardiomyocytes، myocytes، osteocytes، الخلايا الشحمية)، الأنساب الأديم الباطن (خلايا البنكرياس وخلايا الكبد وخلايا الرئة) والأنساب الأدمة (الشعر، والجلد، والخلايا العصبية والخلايا النجمية) 5-10.
مطمئن، على الرغم من hAECs multipotency بهم لا تظهر إلى أي شكل أو أورام تعزيز التنمية الورم في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، hAECs هي أيضا في مأمن حظا، معربا عن انخفاض مستويات مستضدات الكريات البيض الدرجة الثانية البشرية (HLAs) 8. هذا العقار على الأرجح راء قدرتهم على التهرب من الرفض المناعي بعد زرع خيفي وxenogenic، كما هو موضح في الدراسات التي تستخدم القرود المناعة المختصة والأرانب وخنازير غينيا والجرذان والخنازير 11-13. عرض hAECs المناعية قوية وخصائص المثبطة للمناعة وبالتالي توفر مزايا عملية كبيرة لالتطبيقات السريرية المحتملة في علاج أمراض المناعة الذاتية. ويعتقد hAECs لممارسة مهام المناعية على كل من أنظمة المناعة الفطرية والتكيفية. في(ه) من الآليات المقترحة، هو من خلال إفراز المناعية عوامل 14.
وتشمل التطبيقات الحالية للhAECs في نماذج الأمراض الحيوانية ما قبل السريرية لعلاج السكتة الدماغية، والتصلب المتعدد، وأمراض الكبد والسكري وأمراض الرئة المزمنة والحادة. وقد أظهرت الباحثون اهتماما باستخدام hAECs لعلاج ما بعد السكتة الدماغية والتهاب الدماغ بسبب خصائصها الفريدة. هناك أدلة على أن hAECs يمكن عبور حاجز الدم في الدماغ حيث يمكنهم تدبر، البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 60 يوما، وتفرق في الخلايا العصبية، وتقليل الالتهاب وتعزيز تجديد الأنسجة التالفة الجهاز العصبي المركزي في النماذج الحيوانية من الأمراض العصبية 15.
hAECs توفر القدرة على استهداف وعكس مسارات متعددة المرضية التي تساهم في تطور وتقدم مرض التصلب المتعدد. على سبيل المثال، ينتج من الدراسات على الحيوانات ما قبل السريرية تشير إلى أن hAECs هي مناعة بقوة ويمكن أن يحتمل لحث على التسامح المناعي الطرفية وعكس الاستجابات الالتهابية الجارية. كما تبين hAECs لديها القدرة على التمايز إلى خلايا العصبية في الجسم الحي وتعزيز neuroregeneration الذاتية من خلال إفراز مجموعة واسعة من التغذية العصبية عوامل 16.
وقد أظهرت الخلايا الظهارية الإنسان والقوارض السلى بالفعل فعاليتها العلاجية لعلاج أمراض الكبد في النماذج الحيوانية. في رابع كلوريد الكربون نموذج الضرر تحريض أمراض الكبد، وhAEC زرع تؤدي إلى engraftment من hAECs قابلة للحياة في الكبد، وترافق مع انخفاض الخلايا الكبدية، وانخفاض التهاب الكبدي وتليف 17.
hAECs يمكن حفز لعوامل البنكرياس أعرب بما في ذلك الأنسولين والجلوكوز النقل. حققت العديد من الدراسات إمكانية hAECs لاستعادة مستويات السكر في الدم في الفئران السكري 18. في الفئران تلقيhAECs، انخفضت كل من الوزن والسكر في الدم جسم الحيوان المستويات لمستوياتها الطبيعية بعد حقن الخلايا. هذه الدراسات تمثل حجة قوية لاستخدام hAECs لعلاج داء السكري.
hAECs يكون لها دور ثبت في منع وإصلاح التجريبية الحادة والمزمنة إصابة الرئة في كل من الكبار ونماذج حديثي الولادة 19. وجدت هذه الدراسات أن hAECs التفريق في المختبر في الرئة وظيفية الخلايا الظهارية معربا متعددة البروتينات المرتبطة الرئة، بما في ذلك التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR)، والقناة الايونية التي تحور في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي 20. بالإضافة إلى ذلك، عندما يتم تسليم hAECs إلى الكبار المصابين والرئة لحديثي الولادة، وأنها تمارس تأثيراتها تعويضية عن طريق تعديل الخلايا المناعية، والحد من التوظيف الكرية البيضاء الرئوي، بما في ذلك العدلات، الضامة والخلايا اللمفية 21-23.
ونظرا فرة بهم،سجل السلامة، والتطبيقات السريرية مؤكدة لأمراض متعددة، والتجارب السريرية باستخدام hAECs أمر لا مفر منه. وذلك بهدف الإسراع في ترجمة العلاجات hAEC في التجارب السريرية، قمنا بتطوير طرق لعزل وcryopreserve وhAECs الثقافة بطريقة مناسبة للتجارب السريرية، وذلك باستخدام الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية وفقا للممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب) المبادئ التوجيهية .
نحن مقرها هذا البروتوكول بروتوكول نشرت سابقا التي كنا نستخدمها بنجاح لعزل hAECs باستخدام الكواشف المشتقة من الحيوانات 6. نحن تغيير البروتوكول الأصلي ليحل محل المنتجات المشتقة من الحيوانات مع الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية، وأجريت الأمثل لاحق لتحسين العائد الخلية، وسلامة ونقاء. كان هدفنا لوضع بروتوكول من شأنه أن تمتثل للمعايير التنظيمية لتصنيع الخلايا للتجارب السريرية الإنسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من المعلمات الحرجة التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير في نجاح هذه المنهجية. تخزين المشيمة أو السلى لمدة تصل إلى 3 ساعات قبل عزل hAECs قد يكون من المرغوب فيه لأغراض لوجستية أو جدولة، ومع ذلك فمن المستحسن أن تتم معالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن. إذا الأنسجة ليتم تخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Protective Apparel | |||
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. . Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. . Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).
