Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Summary

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Abstract

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.

hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.

We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

Introduction

Células derivadas de fontes perinatais, como a placenta, membranas da placenta, do cordão umbilical e líquido amniótico têm atraído a atenção de pesquisadores e clínicos como uma fonte potencial de células para a medicina regenerativa ^1,2. A razão para este interesse é que estes tipos de células todos possuem algum grau de plasticidade e imunomodulador capacidade ^3, as propriedades que são fundamentais para as suas potenciais aplicações terapêuticas.

hAECs são uma população heterogénea epitelial que podem ser derivados de termo ou pré-termo membrana âmnio ^4, proporcionando uma fonte potencial abundante de material celular regenerativo. As propriedades que tornam hAECs atraentes como uma terapia celular incluem a sua multipotência, baixa imunogenicidade, e propriedades anti-inflamatórias. hAECs foram encontrados para ser altamente multipotentes in vitro e in vivo, capaz de se diferenciar em linhagens mesodérmica (cardiomyocytes, miócitos, osteócitos, adipócitos), linhagens endoderme (células pancreáticas, células hepáticas, células do pulmão) e linhagens ectodérmica (cabelo, pele, células neurais e astrócitos) ^5-10.

Reassuringly, apesar de suas hAECs multipotency parecem não quer formar tumores ou promover o desenvolvimento do tumor in vivo. Além disso, hAECs também são imunes privilegiado, expressando baixos níveis de classe II antígenos leucocitários humanos (HLA) ^8. Esta propriedade provável subjaz a sua capacidade de fugir rejeição imunológica após o transplante alogênico e xenogênico, como demonstrado em estudos com macacos imunes competentes, coelhos, porquinhos da índia, ratos e porcos ^11-13. hAECs exibir imunomodulador potente e propriedades imunossupressoras e, assim, oferecer vantagens práticas significativas para potenciais aplicações clínicas em terapia doença auto-imune. hAECs são acreditados para exercer funções imunomoduladoras em ambos os sistemas imune inata e adaptativa. Eme dos mecanismos sugeridos, é através da secreção de factores de ¹⁴ imunomodulador.

As aplicações atuais de hAECs em modelos pré-clínicos de doenças animais incluem o tratamento de acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, doença hepática, diabetes e doenças pulmonares crônicas e agudas. Pesquisadores demonstraram interesse em utilizar hAECs para tratar pós-AVC inflamação do cérebro, devido às suas propriedades únicas. Há evidências de que hAECs pode atravessar a barreira sanguínea do cérebro, onde eles podem enxertar, para sobreviver até 60 dias, diferenciar-se em neurónios, diminuir a inflamação e promover a regeneração de tecido danificado sistema nervoso central em modelos animais de doenças neurológicas ^15.

hAECs oferecer a capacidade de segmentar e reverter várias vias patológicas que contribuem para o desenvolvimento e progressão de esclerose múltipla. Por exemplo, os resultados de estudos animais pré-clínicos sugerem que hAECs são fortemente e imunossupressorapodem potencialmente induzir tolerância imunológica periférica e reverter respostas inflamatórias em curso. hAECs também têm mostrado ter a capacidade de se diferenciarem em células neuronais in vivo e aumentar neuroregeneração endógeno através da secreção de uma vasta gama de factores neurotróficos ^16.

Células epiteliais humanas e de roedores âmnio já demonstraram a sua eficácia terapêutica para o tratamento de doença do fígado em modelos animais. Em um modelo de indução de lesão tetracloreto de carbono de doença hepática, HAEC transplante liderança para enxerto de hAECs viáveis ​​no fígado, acompanhado de uma diminuição da apoptose dos hepatócitos, e diminuição da inflamação hepática e fibrose ^17.

hAECs podem ser estimulados com factores pancreáticos expressas incluindo insulina e transportadores de glicose. Diversos estudos têm investigado o potencial de hAECs para restaurar os níveis de glicose no sangue em ratos diabéticos ^18. Em ratos que receberamhAECs, tanto a nível de peso e de glicose no sangue do corpo de animais diminuiu para níveis normais após a injeção das células. Estes estudos apresentam um caso forte para o uso de hAECs para o tratamento da diabetes mellitus.

hAECs têm um papel comprovada na prevenção e reparação da lesão pulmonar aguda e crônica em adultos e modelos neonatais ^19. Estes estudos revelaram que hAECs diferenciarem in vitro em células epiteliais do pulmão funcional que expressam múltiplas proteínas associadas à pulmão, incluindo fibrose cística da condutância transmembranar regulador (CFTR), o canal de iões, que é transformado em pacientes com fibrose cística ^20. Além disso, quando hAECs são entregues para o adulto lesionado e pulmonar neonatal, que exercem os seus efeitos através da modulação de reparação de células imunitárias do hospedeiro, reduzindo o recrutamento de leucócitos pulmonar, incluindo neutrófilos, macrófagos e linfócitos ^21-23.

Dada a sua abundância,registro de segurança, e aplicações clínicas comprovadas para várias doenças, os ensaios clínicos utilizando hAECs é inevitável. Com o objetivo de acelerar a tradução de terapias em HAEC de ensaios clínicos, desenvolvemos métodos para isolar, criopreservar e hAECs cultura de uma maneira adequada para os ensaios clínicos, utilizando reagentes sem produtos de origem animal, de acordo com boas práticas de fabricação atuais (cGMP) orientações .

Baseamos este protocolo um protocolo publicado anteriormente que estávamos usando com sucesso para isolar hAECs utilizando reagentes de origem animal ^6. Nós alteramos o protocolo original para substituir os produtos derivados de animais com reagentes livre de produtos de origem animal, e posterior otimização foi realizada para otimizar o rendimento das células, viabilidade e pureza. Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo que iria cumprir com as normas regulamentares de fabricação de células para testes clínicos em humanos.

Protocol

NOTA: Prematuro da Placenta devem ser coletadas de gravidezes saudáveis ​​Singleton, com uma preferência para cesarianas eletivas prazo. Escrito, o consentimento informado deve ser dada para a coleção de sua placenta. Seu comitê de ética em pesquisa em humanos relevantes devem aprovação totalidade da recolha e utilização de tecidos humanos. 1. Isolamento de Células Epiteliais Amnion Coloque a placenta em uma superfície estéril dentro de …

Representative Results

Quando este procedimento é seguido corretamente, um rendimento médio de 120 milhões de hAECs deve ser esperado, com um alcance típico de 80-160000000 células. A partir destes rendimentos, uma viabilidade média de 83 ± 4% pode ser esperado. O aumento do rendimento e a viabilidade média ligeiramente inferior no método clínico pode ser devido a actividade da tripsina maior do que o produto derivado de animal, e, talvez, também devido à ausência de proteínas do soro. Isolado hAECs ter um perfil de superfície …

Discussion

Existem vários parâmetros críticos que podem ter um impacto significativo no sucesso desta metodologia. Armazenamento da placenta ou âmnio por até 3 horas antes do isolamento do hAECs pode ser desejável para fins de logística ou programação, no entanto, recomenda-se que o tecido seja processado o mais rapidamente possível. Se o tecido é para ser armazenada, é recomendado que o armazenamento ser realizada seguindo esvaziamento e lavagem da membrana âmnio. Âmnio pode ser armazenado em HBSS estéril contendo …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Collection Kit
Stripping tray	Fisher Scientific	13-361B
Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm	Fisher Scientific	S17329
Scissors – Sharp/Blunt Straight	Fisher Scientific	NC0562592
Sterile latex gloves	Fisher Scientific	19-014-643
Protective Apparel (Gown)	U-line	S-15374-M
Protective Apparel
Isolation gowns	U-line	S-15374-M
Sterile latex gloves	Fisher Scientific	19-014-643
General purpose face mask	Cardinal Health	AT7511
Bonnets	Medline	CRI1001
Shoe covers	U-line	S-7873W
Media and Reagents
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Life Technologies	14175095	without calcium or magnesium
TrypZean(animal product–free recombinant trypsin)	Sigma Aldrich	T3449
Soybean Trypsin Inhibitor  1g/50mL	Sigma Aldrich	T6522
Cryostor CS5	BioLife Solutions	205102
Trypan blue reagent	Life Technologies	15250-061
anti-EpCam-PE	Miltenyi Biotec	130 – 091-253
PE-isotype control	Miltenyi Biotec	130-098-845
anti-CD90-PeCy5	BD Pharmingen	555597
PeCy5-isotype control	BD Pharmingen	557224
anti-CD105-APC	BD Pharmingen	562408
APC-isotype control	BD Pharmingen	340754
Collagen Type VI	Sigma Aldrich	C7521
Consumables
50mL graduated pipette	BD/Falcon	356550
10mL graduated pipette	BD/Falcon	356551
5mL graduated pipette	BD/Falcon	356543
50mL falcon tubes	BD/Falcon	352070
15mL falcon tubes	BD/Falcon	352096
15-cm petri dishes	Corning	351058
70-μm filters	BD/Falcon	352350
0.22-μm filters	Millipore	SLGV033RS
1ml Pipette tips	Fisherbrand	02-707-401
200ul Pipette tips	Fisherbrand	02-707-409
20ml Syringe	BD/Medical	309661
Plastic spatula	Fisher Scientific	14-245-97
Plastic weighing boat	Fisher Scientific	02-202-102
Cryo vials	Nunc	377267
Equipment
Mr Frosty	Fisher Scientific	A451-4
Biohazard Cabinet