Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Summary

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Abstract

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.

hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.

We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

Introduction

Le cellule derivate da fonti perinatali, come la placenta, membrane placentari, cordone ombelicale e liquido amniotico hanno attirato l'attenzione dei ricercatori e clinici come potenziale fonte di cellule per la medicina rigenerativa ^1,2. La ragione di questo interesse è che questi tipi di cellule tutti possiedono un certo grado di plasticità e immunomodulatorie capacità ^3, proprietà che sono fondamentali per loro potenziali applicazioni terapeutiche.

hAECs sono una popolazione eterogenea epiteliale che può derivare dal termine o pre-termine membrana amniotica ^4, fornendo una abbondante fonte potenziale di materiale cellulare rigenerativa. Le proprietà che rendono hAECs accattivanti come terapia cellulare comprendono la multipotenza, bassa immunogenicità, e le proprietà anti-infiammatorie. hAECs sono stati trovati per essere altamente multipotenti sia in vitro che in vivo, in grado di differenziarsi in linee mesodermici (cardiomyocytes, miociti, osteociti, adipociti), lignaggi endodermici (cellule pancreatiche, cellule epatiche, cellule polmonari) e lignaggi ectodermiche (capelli, pelle, cellule neurali e astrociti) ^5-10.

Rassicurante, nonostante le loro hAECs multipotenza non sembrano né formare tumori o promuovere lo sviluppo del tumore in vivo. Inoltre, hAECs sono immuni privilegiata, esprimendo bassi livelli di classe II antigeni leucociti umani (HLA) ^8. La struttura, probabilmente alla base la capacità di eludere rigetto immunitario dopo il trapianto allogenico e xenogenica, come dimostrato in studi che utilizzano scimmie immunitarie competenti, conigli, cavie, topi e maiali ^11-13. hAECs visualizzare potenti immunomodulante proprietà immunosoppressive e quindi offrono notevoli vantaggi pratici per le potenziali applicazioni cliniche nella terapia delle malattie autoimmuni. hAECs si ritiene di esercitare le funzioni di immunomodulatori sia sul sistema immunitario innato e adattativo. Sue dei meccanismi proposti, è attraverso la secrezione di fattori immunomodulante ^14.

Le attuali applicazioni di hAECs in modelli di malattia degli animali pre-clinici comprendono il trattamento di ictus, sclerosi multipla, malattia del fegato, diabete e malattie polmonari croniche e acute. I ricercatori hanno mostrato interesse ad utilizzare hAECs per il trattamento di post-ictus infiammazione del cervello a causa delle loro proprietà uniche. Ci sono prove che hAECs può attraversare la barriera emato-encefalica, dove possono innestare, sopravvivere fino a 60 giorni, differenziarsi in neuroni, diminuire l'infiammazione e promuovere la rigenerazione del tessuto danneggiato del sistema nervoso centrale in modelli animali di malattie neurologiche ^15.

hAECs offrono la possibilità di individuare e invertire molteplici percorsi patologici che contribuiscono allo sviluppo e la progressione della sclerosi multipla. Ad esempio, i risultati di studi su animali pre-clinici suggeriscono che hAECs fortemente immunosoppressiva epuò potenzialmente indurre tolleranza immunitaria periferica e invertire risposte infiammatorie in corso. hAECs hanno anche dimostrato di avere la capacità di differenziarsi in cellule neurali in vivo e migliorare neurorigenerazione endogena attraverso la secrezione di una vasta gamma di fattori neurotrofici ^16.

Cellule epiteliali umane e roditori amniotiche hanno già dimostrato la loro efficacia terapeutica per il trattamento della malattia epatica in modelli animali. In un modello di tetracloruro di carbonio induzione danni delle malattie del fegato, il trapianto haec portare ad attecchimento di hAECs vitali nel fegato, accompagnato con una ridotta epatociti apoptosi, e diminuito l'infiammazione epatica e fibrosi ^17.

hAECs può essere stimolato da fattori pancreatiche espresse compreso insulina e glucosio trasportatori. Diversi studi hanno indagato la possibilità di hAECs per ripristinare i livelli di glucosio nel sangue in topi diabetici ^18. Nei topi che ricevehAECs, sia di peso e di glucosio nel sangue i livelli del corpo animale è sceso a livelli normali dopo l'iniezione di cellule. Questi studi presentano un caso forte per l'uso di hAECs per il trattamento del diabete mellito.

hAECs hanno un ruolo provata nella prevenzione e riparazione di sperimentale danno polmonare acuto e cronico in modelli neonatali ¹⁹ adulti e. Questi studi hanno trovato che hAECs differenziano in vitro in cellule epiteliali polmonari funzionale che esprimono più proteine ​​polmonari associate, tra cui la fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), il canale ionico che è mutato in pazienti affetti da fibrosi cistica ^20. Inoltre, quando hAECs vengono consegnati l'adulto ferito e polmonare neonatale, che esercitano i loro effetti riparatori tramite la modulazione delle cellule immunitarie dell'ospite, riducendo il reclutamento dei leucociti polmonare, tra cui neutrofili, macrofagi e linfociti ^21-23.

Data la loro abbondanza,record di sicurezza, e le applicazioni cliniche collaudate per più malattie, studi clinici utilizzando hAECs è inevitabile. Con l'obiettivo di accelerare la traduzione di terapie HAEC in sperimentazioni cliniche, abbiamo sviluppato metodi per isolare, criopreservare e hAECs cultura in un modo adatto per la sperimentazione clinica, utilizzando reagenti senza prodotti di origine animale in conformità alle buone pratiche di fabbricazione (cGMP) le linee guida .

Abbiamo basato questo protocollo un protocollo precedentemente pubblicato che stavamo usando con successo per isolare hAECs utilizzando reagenti di origine animale ^6. Abbiamo modificato il protocollo originale di sostituire i prodotti di origine animale con reagenti privi di prodotti animali, e la successiva ottimizzazione è stata eseguita per ottimizzare il rendimento delle cellule, la vitalità e purezza. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo che rispettare le norme regolamentari per la produzione di celle per test clinici sull'uomo.

Protocol

NOTA: placenta dovrebbe essere raccolto da gravidanze sane Singleton, con una preferenza per tagli cesarei elettivi termine. Scritto, consenso informato deve essere dato per la raccolta dei loro placenta. Il tuo comitati etici di ricerca umani dovrebbero approvazione tutta la linea e l'utilizzo di tessuti umani. 1. Isolamento di cellule epiteliali Amnion Posizionare la placenta su una superficie sterile all'interno di una cappa di sicurezza biolo…

Representative Results

Quando questa procedura è seguita correttamente, una resa media di 120 milioni di hAECs dovrebbe essere previsto, con un raggio di 80-160,000,000 cellule. Da queste rese, una redditività media di 83 ± 4% può essere previsto. La maggiore resa media e leggermente inferiore redditività nel metodo clinica possono essere dovuti all'attività tripsina superiore prodotto di origine animale, e forse anche a causa della mancanza di proteine ​​del siero. Isolati hAECs hanno un profilo medio della superficie cellulare…

Discussion

Ci sono diversi parametri critici che possono avere un impatto significativo per il successo di questa metodologia. Conservazione della placenta o amnion fino a 3 ore prima isolamento di hAECs può essere desiderabile per scopi logistici o di programmazione, ma si raccomanda che il tessuto viene elaborata appena possibile. Se il tessuto deve essere memorizzato, si raccomanda di memorizzazione eseguito in seguito dissezione e lavaggio della membrana amnion. Amnion può essere immagazzinato in HBSS sterili contenenti anti…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Collection Kit
Stripping tray	Fisher Scientific	13-361B
Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm	Fisher Scientific	S17329
Scissors – Sharp/Blunt Straight	Fisher Scientific	NC0562592
Sterile latex gloves	Fisher Scientific	19-014-643
Protective Apparel (Gown)	U-line	S-15374-M
Protective Apparel
Isolation gowns	U-line	S-15374-M
Sterile latex gloves	Fisher Scientific	19-014-643
General purpose face mask	Cardinal Health	AT7511
Bonnets	Medline	CRI1001
Shoe covers	U-line	S-7873W
Media and Reagents
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Life Technologies	14175095	without calcium or magnesium
TrypZean(animal product–free recombinant trypsin)	Sigma Aldrich	T3449
Soybean Trypsin Inhibitor  1g/50mL	Sigma Aldrich	T6522
Cryostor CS5	BioLife Solutions	205102
Trypan blue reagent	Life Technologies	15250-061
anti-EpCam-PE	Miltenyi Biotec	130 – 091-253
PE-isotype control	Miltenyi Biotec	130-098-845
anti-CD90-PeCy5	BD Pharmingen	555597
PeCy5-isotype control	BD Pharmingen	557224
anti-CD105-APC	BD Pharmingen	562408
APC-isotype control	BD Pharmingen	340754
Collagen Type VI	Sigma Aldrich	C7521
Consumables
50mL graduated pipette	BD/Falcon	356550
10mL graduated pipette	BD/Falcon	356551
5mL graduated pipette	BD/Falcon	356543
50mL falcon tubes	BD/Falcon	352070
15mL falcon tubes	BD/Falcon	352096
15-cm petri dishes	Corning	351058
70-μm filters	BD/Falcon	352350
0.22-μm filters	Millipore	SLGV033RS
1ml Pipette tips	Fisherbrand	02-707-401
200ul Pipette tips	Fisherbrand	02-707-409
20ml Syringe	BD/Medical	309661
Plastic spatula	Fisher Scientific	14-245-97
Plastic weighing boat	Fisher Scientific	02-202-102
Cryo vials	Nunc	377267
Equipment
Mr Frosty	Fisher Scientific	A451-4
Biohazard Cabinet