Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule epiteliali amniologiche umane (hAEC) utilizzando reagenti privi di prodotti animali in conformità con le attuali linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione (cGMP).
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Articolo metodologico
Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule epiteliali amniologiche umane (hAEC) derivate da membrane amnioiche a termine o pre-termine hanno attirato l'attenzione di ricercatori e medici come potenziale fonte di cellule per la medicina rigenerativa. La ragione di questo interesse è l'evidenza che queste cellule hanno un'elevata capacità di differenziazione multipotente, bassa immunogenicità e funzioni antinfiammatorie. Queste proprietà hanno spinto i ricercatori a studiare il potenziale degli hAEC da utilizzare per trattare una varietà di malattie e disturbi in studi preclinici sugli animali con molto successo.
hAEC hanno trovato ampia applicazione per il trattamento di una serie di malattie e disturbi. Le potenziali applicazioni cliniche degli hAEC includono il trattamento dell'ictus, della sclerosi multipla, delle malattie epatiche, del diabete e delle malattie polmonari croniche e acute. Il passaggio dagli studi preclinici sugli animali agli studi clinici richiede uno standard più elevato di controllo della qualità e sicurezza per i prodotti di terapia cellulare. Per considerazioni sulla sicurezza e sul controllo della qualità, è preferibile che i protocolli di isolamento cellulare utilizzino reagenti privi di prodotti di origine animale.
Abbiamo sviluppato protocolli per consentire ai ricercatori di isolare, crioconservare e coltivare hAEC utilizzando reagenti privi di prodotti animali. Il vantaggio di questo metodo è che queste cellule possono essere isolate, caratterizzate, crioconservate e coltivate senza il rischio di veicolare agenti patogeni animali potenzialmente dannosi per l'uomo, mantenendo al contempo rese cellulari, vitalità e potenziale di crescita adeguati. Per i ricercatori che passano dagli studi preclinici sugli animali agli studi clinici, queste metodologie accelereranno notevolmente l'approvazione normativa, ridurranno i rischi e miglioreranno la qualità della loro popolazione di cellule terapeutiche.
Introduzione
Le cellule derivate da fonti perinatali, come la placenta, membrane placentari, cordone ombelicale e liquido amniotico hanno attirato l'attenzione dei ricercatori e clinici come potenziale fonte di cellule per la medicina rigenerativa 1,2. La ragione di questo interesse è che questi tipi di cellule tutti possiedono un certo grado di plasticità e immunomodulatorie capacità 3, proprietà che sono fondamentali per loro potenziali applicazioni terapeutiche.
hAECs sono una popolazione eterogenea epiteliale che può derivare dal termine o pre-termine membrana amniotica 4, fornendo una abbondante fonte potenzia....
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Protocollo
NOTA: placenta dovrebbe essere raccolto da gravidanze sane Singleton, con una preferenza per tagli cesarei elettivi termine. Scritto, consenso informato deve essere dato per la raccolta dei loro placenta. Il tuo comitati etici di ricerca umani dovrebbero approvazione tutta la linea e l'utilizzo di tessuti umani.
1. Isolamento di cellule epiteliali Amnion
- Posizionare la placenta su una superficie sterile all'interno di una cappa di sicurezza biologica di classe II.
- Utilizzando matasse sterili soluzione salina bilanciata (HBSS), lavare il più sangue possibile dalla superficie della pla....
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Risultati
Quando questa procedura è seguita correttamente, una resa media di 120 milioni di hAECs dovrebbe essere previsto, con un raggio di 80-160,000,000 cellule. Da queste rese, una redditività media di 83 ± 4% può essere previsto. La maggiore resa media e leggermente inferiore redditività nel metodo clinica possono essere dovuti all'attività tripsina superiore prodotto di origine animale, e forse anche a causa della mancanza di proteine del siero. Isolati hAECs hanno un profilo medio della superficie cellulare del 92% EpCAM.......
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Discussione
Ci sono diversi parametri critici che possono avere un impatto significativo per il successo di questa metodologia. Conservazione della placenta o amnion fino a 3 ore prima isolamento di hAECs può essere desiderabile per scopi logistici o di programmazione, ma si raccomanda che il tessuto viene elaborata appena possibile. Se il tessuto deve essere memorizzato, si raccomanda di memorizzazione eseguito in seguito dissezione e lavaggio della membrana amnion. Amnion può essere immagazzinato in HBSS sterili contenenti antibi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del Programma di Supporto alle Infrastrutture Operative del Governo del Victoria.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit | |||
| Vassoio di strippaggio | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Pinza per medicazione Liberty, appuntita 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Forbici - Affilate/Smussate Dritte | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Guanti sterili in lattice | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Abbigliamento | |||
| Abbigliamento protettivo (camice) | U-line | S-15374-M | |
| Camici isolanti | U-line | S-15374-M | |
| Guanti sterili in lattice | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Mascherina per uso generico | Cardinal Health | AT7511 | |
| Cofani | Medline | CRI1001 | |
| Copriscarpe | U-line | S-7873W | |
| Media e reagenti | |||
| Hanks' Soluzione salina bilanciata (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | senza calcio o magnesio |
| TrypZean (prodotto animale... tripsina ricombinante libera) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Inibitore della tripsina di soia 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Reagente blu di tripano | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| Isotipo PE controllo | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| controllo dell'isotipo PeCy5 | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| controllo dell'isotipo APC | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagene di tipo VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Materiali di | |||
| Pipetta graduata da 50 ml | BD/Falcon | 356550 | |
| Pipetta graduata da 10 ml | BD/Falcon | 356551 | |
| Pipetta graduata da 5 ml | BD/Falcon | 356543 | |
| Provette Falcon da 50 ml | BD/Falcon | 352070 | |
| Provette Falcon da 15 ml | BD/Falcon | 352096 | |
| Piastre Petri da 15 cm | Corning | 351058 | |
| 70 μ m filtri | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μ m filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Puntali per pipette | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μ l Puntali per pipette | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| Siringa da 20 ml | BD/Medical | 309661 | |
| Spatola in plastica | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Pesatrice in plastica | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Fiale criogeniche | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Armadio |
Riferimenti
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med.
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Ristampe e permessi
