Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen
Summary
We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Abstract
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Introduction
Zellen von perinatalen Quellen, wie Plazenta, Plazentamembranen, Nabelschnur und Fruchtwasser abgeleitet haben die Aufmerksamkeit von Forschern und Klinikern als potentielle Quelle von Zellen für die regenerative Medizin 1,2 angezogen. Der Grund für dieses Interesse ist, dass diese Zelltypen besitzen alle ein gewisses Maß an Plastizität und immunmodulatorische Fähigkeit 3, Eigenschaften, die von grundlegender Bedeutung für ihre mögliche therapeutische Anwendungen geeignet sind.
hAECs sind eine heterogene Population Epithelzellen, die aus Laufzeit oder vorzeitigen Amnionmembran 4 abgeleitet werden kann, wodurch ein reichliches potentielle Quelle für regenerative Zellmaterial. Die Eigenschaften, die hAECs ansprechend als Zelltherapie machen gehören ihrer Multi, geringe Immunogenität und entzündungshemmende Eigenschaften. hAECs gefunden wurden hochmulti sowohl in vitro als auch in vivo, zur Differenzierung zu mesodermalen Abstammungslinien zu sein (cardiomyocytes, Muskelzellen, Knochenzellen, Fettzellen), endodermalen Linien (Bauchspeicheldrüsenzellen, Leberzellen, Lungenzellen) und ektodermalen Linien (Haare, Haut, Nervenzellen und Astrozyten) 5-10.
Beruhigend, trotz ihrer Multipotenz hAECs Sie nicht, entweder Form Tumoren erscheinen oder zu fördern Tumorentwicklung in vivo. Darüber hinaus sind auch hAECs Immun privilegierten, zum Ausdruck geringe Klasse II Human-Leukozyten-Antigene (HLA) 8. Diese Eigenschaft wahrscheinlich zugrunde ihre Fähigkeit, Immunabstoßung nach allogener und xenogener Transplantation zu entgehen, wie in Studien mit immunkompetenten Affen, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten und Schweine von 11 bis 13 gezeigt. hAECs anzuzeigen potente immunmodulatorische und immunsuppressive Eigenschaften und bieten somit erhebliche praktische Vorteile für potentielle klinische Anwendungen bei Autoimmunerkrankungen Therapie. hAECs sind vermutlich immunmodulatorische Funktionen sowohl auf der angeborenen und adaptiven Immunsystem auszuüben. Aufe der Mechanismen vorgeschlagen, ist durch die Sekretion von immunmodulatorische Faktoren 14.
Aktuelle Anwendungen der hAECs in vorklinischen Tierkrankheitsmodellen gehören die Behandlung von Schlaganfall, Multiple Sklerose, Lebererkrankungen, Diabetes und chronischen und akuten Lungenerkrankungen. Forscher haben Interesse an der Nutzung hAECs um nach Schlaganfall Gehirn Entzündung aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften gezeigt. Es gibt Hinweise darauf, dass hAECs die Blut-Hirn-Schranke, wo sie engraft überqueren können, überleben für bis zu 60 Tage, zu differenzieren zu Neuronen, verringern Entzündungen und fördern Regeneration geschädigter Gewebe des zentralen Nervensystems in Tiermodellen für neurologische Erkrankungen 15.
hAECs bieten die Möglichkeit, gezielt und Rückwärts mehrere pathologische Wege, die zu der Entwicklung und Progression von Multipler Sklerose bei. Beispielsweise ergibt sich aus der präklinischen Tierstudien legen nahe, dass hAECs stark immunsuppressive undpotenziell induzieren peripheren Immuntoleranz und Reverse laufenden Entzündungsreaktionen. hAECs haben auch gezeigt, dass die Fähigkeit, in vivo in neurale Zellen zu differenzieren und zu verbessern endogenen Neuroregeneration durch die Sekretion einer Vielzahl von neurotrophen Faktoren 16 haben.
Mensch und Nager Amnion Epithelzellen haben bereits ihre therapeutische Wirksamkeit nachgewiesen für die Behandlung von Lebererkrankungen in Tiermodellen. In einem Tetrachlorkohlenstoff Schäden Induktions Modell einer Lebererkrankung, HAEC Transplantation führen zur Verpflanzung von lebensfähigen hAECs in der Leber, in Begleitung mit reduzierter Hepatozyten Apoptose und Verminderung der Leberentzündung und Fibrose 17.
hAECs kann ausgedrückt Pankreas Faktoren, einschließlich Insulin und Glucose-Transporter stimuliert werden. Mehrere Studien haben das Potenzial für hAECs den Blutglucosespiegel in diabetischen Mäusen 18 wiederherzustellen sucht. In Mäusen, diehAECs verringerte beide Tierkörpergewicht und den Blutzuckerspiegel auf ein normales Niveau nach der Injektion von Zellen. Diese Studien stellen ein starkes Argument für den Einsatz von hAECs zur Behandlung von Diabetes mellitus.
hAECs haben eine nachgewiesene Rolle bei der Prävention und Reparatur von experimentellen akuten und chronischen Lungenschädigung in Erwachsenen und Neugeborenen-Modelle 19. Diese Studien zeigten, dass hAECs Differenzierung in vitro in funktionaler Lungenepithelzellen exprimieren multiple Lungen-assoziierten Proteine, einschließlich Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), des Ionenkanals, die bei Patienten mit zystischer Fibrose 20 mutiert ist. Außerdem, wenn hAECs an den verletzten Erwachsenen und Neugeborenen Lunge zugeführt, die reparative Wirkungen auszuüben sie über die Modulation der Immunzellen, wodurch Lungen Leukozytenrekrutierung, einschließlich Neutrophilen, Makrophagen und Lymphozyten 21-23.
Angesichts ihrer Hülle und Fülle,Sicherheitsbilanz und bewährte klinische Anwendungen für mehrere Krankheiten, klinische Studien mit hAECs ist unvermeidlich. Mit dem Ziel, beschleunigte Umsetzung HAEC Therapien in klinischen Studien-entwickelten wir Methoden, um in einer für die klinischen Studien Weise zu isolieren, Kryokonservierung und Kultur hAECs mit Tierproduktfreien Reagenzien gemäß den aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) Leitlinien .
Wir basieren diesem Protokoll eine zuvor veröffentlichte Protokoll, das wir erfolgreich verwendet haben, um hAECs Verwendung von Tieren stammenden Reagenzien 6 zu isolieren. Wir veränderten das ursprüngliche Protokoll an Tieren stammenden Produkte mit tierischen Erzeugnissen freien Reagenzien zu ersetzen, und die anschließende Optimierung durchgeführt, um die Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit zu optimieren. Unser Ziel war es, ein Protokoll, das mit regulatorischen Standards für Zellfertigung für den menschlichen klinischen Studien erfüllen zu entwickeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere kritische Parameter, die erhebliche Auswirkungen auf den Erfolg dieser Methode haben können. Speicherung der Plazenta oder Amnion für 3 h vor der Isolierung hAECs kann logistischer oder Planungszwecke wünschenswert sein, es wird jedoch empfohlen, dass das Gewebe so schnell wie möglich verarbeitet werden. Wenn Gewebe gelagert werden soll, ist es empfehlenswert, dass der Lagerung nach der Präparation und Waschen der Amnionmembran geführt werden. Amnion in sterile HBSS mit Antibiotika bei 4 ° C gelag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Protective Apparel | |||
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
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