We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Cellules dérivées de sources périnatales, comme le placenta, les membranes placentaires, le cordon ombilical et le liquide amniotique ont attiré l'attention des chercheurs et des cliniciens comme une source potentielle de cellules pour la médecine régénérative 1,2. La raison de cet intérêt est que ces types de cellules possèdent toutes un certain degré de plasticité et immunomodulateur capacité 3, propriétés qui sont fondamentales à leurs applications thérapeutiques potentielles.
HAECs sont une population hétérogène qui épithéliale peut être dérivé de terme ou avant terme membrane amniotique 4, fournissant une source potentielle abondante de matériel cellulaire régénérative. Les propriétés qui rendent HAECs faisant appel en tant que thérapie cellulaire comprennent leur multipotence, une faible immunogénicité, et des propriétés anti-inflammatoires. HAECs se sont révélés être très multipotentes in vitro et in vivo, capable de se différencier en lignées mésodermiques (cardiomyocytes, myocytes, ostéocytes, adipocytes), lignées endodermiques (cellules pancréatiques, les cellules hépatiques, les cellules pulmonaires) et lignages ectodermiques (cheveux, peau, cellules neurales et astrocytes) 5-10.
Rassurant, malgré leurs HAECs de multipotence ne semblent pas soit de former des tumeurs ou de promouvoir le développement de la tumeur in vivo. En outre, sont également HAECs immunitaire privilégié, exprimant de faibles niveaux de classe II antigènes de leucocytes humains courante (AcVC) 8. Cette propriété sous-tend probablement leur capacité à échapper rejet immunitaire après transplantation allogénique et xénogénique, comme l'a démontré dans des études sur des singes immunitaires compétentes, lapins, cobayes, rats et cochons 11-13. HAECs afficher immunomodulateur puissant et des propriétés immunosuppressives et offrent ainsi des avantages pratiques importants pour les applications cliniques potentielles dans la thérapie de la maladie auto-immune. HAECs sont soupçonnés d'exercer des fonctions immunomodulatrices sur les deux systèmes immunitaires innées et adaptatives. Sure des mécanismes suggérés, est par la sécrétion de facteurs immunomodulateur 14.
Les applications actuelles de HAECs dans les modèles de maladies animales précliniques comprennent le traitement des accidents vasculaires cérébraux, la sclérose en plaques, une maladie du foie, le diabète et les maladies pulmonaires chroniques et aiguës. Les chercheurs ont montré intérêt à utiliser pour traiter HAECs post-AVC inflammation du cerveau en raison de leurs propriétés uniques. Il est prouvé que HAECs peut traverser la barrière hémato-encéphalique où ils peuvent se greffer, survivre jusqu'à 60 jours, se différencier en neurones, diminuer l'inflammation et favoriser la régénération des tissus du système nerveux central endommagé dans des modèles animaux de maladies neurologiques 15.
HAECs offrent la possibilité de cibler de multiples voies et inverser pathologiques qui contribuent au développement et à la progression de la sclérose en plaques. Par exemple, les résultats provenant d'études animales précliniques suggèrent que HAECs sont fortement immunosuppressive etpeut potentiellement induire une tolérance immunitaire périphérique et inverser les réponses inflammatoires en cours. HAECs se sont également avérés avoir la capacité de se différencier en cellules neurales in vivo et améliorer neurorégénération endogène par la sécrétion d'une vaste gamme de facteurs neurotrophiques 16.
Les cellules épithéliales amniotiques humaines et de rongeurs ont déjà prouvé leur efficacité thérapeutique pour le traitement de maladie du foie chez des modèles animaux. Dans un modèle de maladie du foie, la transplantation d'haec conduisent à la prise de greffe de HAECs viables dans le foie, accompagnée d'une réduction de l'apoptose des hépatocytes dommages induction tétrachlorure de carbone, et une diminution de l'inflammation et de la fibrose hépatique 17.
HAECs peut être stimulée à des facteurs pancréatiques exprimées notamment insuline et de glucose transporteurs. Plusieurs études ont étudié le potentiel de HAECs pour rétablir les niveaux de glucose dans le sang chez les souris diabétiques 18. Chez les souris recevantHAECs, deux poids et la glycémie niveaux du corps des animaux a diminué à des niveaux normaux après l'injection des cellules. Ces études présentent un dossier solide pour l'utilisation de HAECs pour le traitement du diabète sucré.
HAECs ont un rôle avéré dans la prévention et la réparation de lésion pulmonaire aiguë et chronique expérimentale dans les deux adultes et néonatales 19 modèles. Ces études ont révélé que HAECs différencient in vitro dans des cellules epitheliales pulmonaires fonctionnel exprimant de multiples protéines pulmonaires associées, y compris Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), le canal ionique qui est muté chez les patients atteints de fibrose kystique 20. En outre, lorsque HAECs sont livrés à l'adulte lésée et du poumon néonatal, ils exercent leurs effets par l'intermédiaire de la modulation de réparation des cellules immunitaires de l'hôte, ce qui réduit le recrutement des leucocytes pulmonaire, y compris les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes 21-23.
Compte tenu de leur abondance,dossier de sécurité, et les applications cliniques éprouvées pour plusieurs maladies, les essais cliniques utilisant HAECs est inévitable. Dans le but d'accélérer l'application des thérapies haec en cliniques-essais, nous avons développé des méthodes pour isoler, la cryoconservation et HAECs de la culture d'une manière appropriée pour les essais cliniques, en utilisant des réactifs de libre-produits d'animaux conformément aux pratiques de fabrication actuelles bonnes (cGMP) des lignes directrices .
Nous avons fondé ce protocole un protocole déjà publié que nous utilisions avec succès pour isoler HAECs utilisant des réactifs d'origine animale 6. Nous avons modifié le protocole original pour remplacer les produits d'origine animale avec des réactifs de libre-produits animaux, et l'optimisation ultérieure a été effectuée pour optimiser le rendement de la cellule, la viabilité et la pureté. Notre objectif était de développer un protocole qui serait conforme aux normes réglementaires pour la fabrication de cellules pour des essais cliniques humains.
Il ya plusieurs paramètres critiques qui peuvent avoir un impact important dans le succès de cette méthodologie. Stockage du placenta ou amnios jusqu'à 3 heures avant l'isolement du HAECs peut être souhaitable à des fins logistiques ou d'horaires, il est toutefois recommandé que le tissu est traité dès que possible. Si le tissu doit être stocké, il est recommandé que le stockage est effectué après dissection et de lavage de la membrane amniotique. Amnios peut être stocké dans HBSS contenant d…
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Collection Kit | |||
Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
Protective Apparel | |||
Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
Bonnets | Medline | CRI1001 | |
Shoe covers | U-line | S-7873W | |
Media and Reagents | |||
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
Consumables | |||
50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
Cryo vials | Nunc | 377267 | |
Equipment | |||
Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
Biohazard Cabinet |