분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포
Summary
We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Abstract
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Introduction
이러한 태반과 같은 주 산기 소스, 태반 막, 탯줄과 양수에서 파생 된 세포는 재생 의학 1,2 세포의 잠재적 인 소스로 연구자와 임상의의 주목을 받고있다. 이 관심의 이유는이 세포 유형 모두 소성 및 면역 기능 3, 그들의 잠재적 인 치료 응용 프로그램에 대한 기본적인 특성을 어느 정도 가지고 있다는 것입니다.
hAECs 회생 세포 물질의 풍부한 전위 소스를 제공, 용어 또는 용어 사전 양막 멤브레인 (4)로부터 유도 될 수 상피 이종 집단이다. 세포 치료 매력적 hAECs을 속성은 자신의 다 능성, 낮은 면역 원성 및 항 염증 기능을 포함한다. hAECs은 (높은 시험 관내 및 생체 내 둘 다 능성 중배엽 계통으로 분화 할 수 cardiom를 밝혀졌다yocytes, 근육 세포, 골 세포, 지방 세포), 내배엽 계통 (췌장 세포, 간 세포, 폐 세포)와 외배엽 계통 (헤어, 피부, 신경 세포와 성상 세포) 5-10.
안심, 자신의 다 능성의 hAECs 어느 형태의 종양에 표시 또는 생체 내에서 종양 발생을 촉진하지 않습니다에도 불구하고. 또한, hAECs 또한 클래스 II 인간 백혈구 항원 (HLAs) 8의 낮은 수준을 표현, 특권 면역 있습니다. 이 속성은 가능성이 면역 능력 원숭이, 토끼, 기니피그, 쥐, 돼지 11 ~ 13을 사용하여 연구에서 입증 된 바와 같이, 동종 및 이종 이식 후 면역 거부를 회피 할 수있는 능력의 기초가. hAECs는 강력한 면역 조절 및 면역 속성을 표시함으로써자가 면역 질환 치료에 잠재적 인 임상 응용 프로그램에 대한 중요한 실용적인 장점을 제공한다. hAECs는 모두 선천성 및 후천성 면역 시스템에서 면역 기능을 발휘하는 것으로 추정된다. 에면역의 분비가 (14) 요인을 통해 제안 된 메커니즘의 전자입니다.
전임상 동물 질병 모델에서 hAECs 현재 애플리케이션은 뇌졸중, 다발성 경화증, 간 질환, 당뇨병 및 만성 폐 질환의 치료를 포함한다. 연구자들은 그들의 고유 한 속성에 뇌졸중 후 뇌 염증을 치료하는 hAECs를 사용에 관심을 보여 주었다. hAECs, 그들은 생착 할 수있는 혈액 뇌 장벽을 통과 최대 60 일 동안 생존, 뉴런으로 분화, 염증을 감소시키고 신경 질환 (15)의 동물 모델에서 손상된 중추 신경계 조직의 재생을 촉진 할 수 있다는 증거가있다.
hAECs 타겟팅 및 다발성 경화증의 발생 및 진행에 기여하는 여러 병리학 적 경로를 취소하는 기능을 제공한다. 예를 들면, 전임상 동물 실험의 결과 hAECs 강하게 면역 것을 제안하고잠재적으로 말초 면역 관용을 유도하고 지속적인 염증 반응을 취소 할 수 있습니다. hAECs는 또한 생체 내에서 신경 세포로 분화 및 신경성의 방대한 16 인자 분비를 통해 내인성 신경 재생을 향상시키는 능력을 갖는 것을 나타내고있다.
설치류 및 인간 양막 상피 세포는 이미 동물 모델에서 간 질환의 치료를위한 그들의 치료 효능을 증명하고있다. 감소 된 간세포 자멸사 수반 간 질환, 간에서의 생착 가능한 hAECs HAEC에 이식 리드의 사염화탄소 유도 손상 모델에서 간 염증 및 섬유증 및 17의 감소.
hAECs는 인슐린과 포도당 수송을 포함하여 표현 췌장 요인으로 자극 할 수있다. 몇몇 연구는 당뇨병 마우스 (18)에서 혈당 수준을 복원 hAECs 가능성을 조사 하였다. 마우스에서 수신hAECs는 모두 동물 체중 및 혈당 수준은 감염 후 세포의 정상 수준으로 감소 하였다. 이들 연구는 당뇨병의 치료를위한 hAECs의 사용을위한 강력한 바이다.
hAECs는 성인과 신생아 모델 19 두의 예방 및 실험 급성 및 만성 폐 손상의 수리 검증 역할을한다. 이러한 연구는 hAECs은 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR), 낭포 성 섬유증 (20) 환자에서 돌연변이 이온 채널 등 다양한 폐 관련 단백질을 발현하는 기능 폐 상피 세포로 체외에서 분화 것을 발견했다. hAECs가 부상당한 성인과 신생아 폐에 전달 될 때 또한, 그들은 호중구, 대 식세포와 림프구 21-23을 포함한 폐 백혈구 모집을 감소, 호스트 면역 세포의 변조를 통해 자신의 수복 효과를 발휘한다.
자신의 풍요 로움을 감안할 때,안전 기록, 여러 질병에 대한 입증 된 임상 적용, hAECs를 사용하여 임상 시험은 불가피하다. 임상 시험에 HAEC 치료의 번역을 촉진 목표로, 우리는 현재 좋은 제조 기준 (cGMP의) 지침에 따라 동물 제품 무료 시약을 사용하여, 임상 시험에 적합한 방식으로 문화 hAECs을 분리 cryopreserve과하는 방법을 개발 .
우리는이 프로토콜에게 우리가 동물 유래 시약 6을 사용 hAECs을 분리 성공적으로 사용하고 이전에 출판 된 프로토콜을 기반으로. 우리는 동물 제품 무료 시약 동물 유래 제품을 대체 할 수있는 원래의 프로토콜을 변경, 이후의 최적화는 세포 수율, 생존 및 순도를 최적화하기 위해 실시 하였다. 우리의 목표는 인간의 임상 시험에 대한 전지 제조에 대한 규제 기준을 준수 할 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법의 성공에 중요한 영향을 미칠 수있는 몇 가지 중요한 매개 변수가 있습니다. hAECs의 분리하기 전에 최대 3 시간 동안 태반이나 양막의 저장 그러나 그것은 조직은 가능한 한 빨리 처리하는 것이 좋습니다, 물류 또는 스케줄링을 위해 바람직 할 수있다. 티슈가 저장 될 경우에는 저장 양막 막의 박리 및 세정 다음 수행하는 것이 권장된다. 양막은 39 ° C에서 멸균 항생제를 함유하는 HBSS에 저?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Protective Apparel | |||
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
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