Isolatie, cryopreservatie en cultuur van de mens Amnion epitheelcellen voor klinische toepassingen
Summary
We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Abstract
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Introduction
Cellen afkomstig van perinatale bronnen, zoals de placenta, placentamembranen, navelstreng en vruchtwater zijn aandacht van wetenschappers en artsen aangetrokken als een potentiële bron van cellen voor regeneratieve geneeskunde 1,2. De reden voor deze belangstelling is dat deze celtypen bezitten allemaal een zekere mate van plasticiteit en immunomodulerende capaciteit 3, eigenschappen die essentieel zijn voor de mogelijke therapeutische toepassingen.
hAECs zijn een heterogene populatie epitheliale die kunnen worden ontleend term of premature amnion membraan 4, die een rijke potentiële bron van regeneratieve celmateriaal. De eigenschappen die hAECs aantrekkelijk als een cellulaire therapie te maken onder hun multipotentie, lage immunogeniciteit, en anti-inflammatoire eigenschappen. hAECs gevonden zeer multipotente zowel in vitro als in vivo kunnen differentiëren tot mesodermale lineages is (cardiomyocytes, myocytes, osteocyten, adipocyten), endodermale geslachten (pancreas cellen, levercellen, longcellen) en ectodermale geslachten (haar, huid, neurale cellen en astrocyten) 5-10.
Geruststellend, ondanks hun multipotent hAECs lijken niet beide vormen tumoren of bevorderen de ontwikkeling van tumoren in vivo. Verder hAECs zijn ook immuun bevoorrecht, uiten lage niveaus van klasse II menselijke leukocyten antigenen (HLAs) 8. Deze eigenschap waarschijnlijk ten grondslag vertrouwde afstoting omzeilen na allogene en xenogene transplantatie, zoals aangetoond in onderzoeken met immuuncompetente apen, konijnen, cavia's, ratten en varkens 11-13. hAECs geven krachtige immunomodulerende en immunosuppressieve eigenschappen en bieden daarmee belangrijke praktische voordelen voor potentiële klinische toepassingen in de auto-immuunziekte therapie. hAECs worden verondersteld immunomodulerende functie uit te oefenen op zowel het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Ope van de mechanismen gesuggereerd is door de afscheiding van immunomodulerende factoren 14.
Momenteel houdt hAECs in preklinische dierlijke ziektemodellen omvatten de behandeling van een beroerte, multiple sclerose, leverziekte, diabetes en chronische en acute longziekten. Onderzoekers hebben interesse getoond in het gebruik hAECs om na een beroerte ontsteking van de hersenen te behandelen vanwege hun unieke eigenschappen. Er is bewijs dat hAECs de bloed-hersenbarrière, waar ze kunnen engraft kunnen oversteken, overleven voor maximaal 60 dagen, differentiëren in neuronen, ontsteking te verminderen en het bevorderen van de regeneratie van beschadigde centrale zenuwstelsel weefsel in diermodellen van neurologische aandoeningen 15.
hAECs bieden de mogelijkheid te richten en reverse meerdere pathologische trajecten die bijdragen aan de ontwikkeling en progressie van multiple sclerose. Bijvoorbeeld, het gevolg is van preklinische dierstudies suggereren dat hAECs sterk immunosuppressieve enkan mogelijk perifere immuun tolerantie induceren en achteruit lopend ontstekingsreacties. hAECs hebben ook aangetoond dat het vermogen om te differentiëren tot neurale cellen in vivo en versterken endogene neuroregeneratie door de afscheiding van een breed scala van neurotrofe factoren 16 hebben.
Menselijke en knaagdieren amnion epitheelcellen hebben hun therapeutische werkzaamheid aangetoond voor de behandeling van leverziekte bij diermodellen. In een tetrachloorkoolstof schade inductie model van leverziekte, HAEC transplantatie leiden tot innesteling van levensvatbare hAECs in de lever, gepaard met verminderde hepatocyt apoptose en verminderde hepatische inflammatie en fibrose 17.
hAECs kunnen worden gestimuleerd om uitgedrukt alvleesklier factoren, waaronder insuline en glucose-transporters. Verschillende studies hebben het potentieel onderzocht voor hAECs om de bloedsuikerspiegel te herstellen in diabetische muizen 18. In muizen diehAECs zowel dierlijk lichaamsgewicht en bloedsuikerspiegel daalde tot normale niveaus na injectie van cellen. Deze studies vormen een krachtig argument voor het gebruik van hAECs voor de behandeling van diabetes mellitus.
hAECs een bewezen rol bij het voorkomen en herstellen van experimentele acute en chronische longschade in zowel volwassen en neonatale modellen 19. Deze studies gevonden dat hAECs differentiëren in vitro in functionele longepitheelcellen expressie meerdere long geassocieerde eiwitten, waaronder Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), het ionkanaal dat mutaties in patiënten met cystische fibrose 20. Bovendien, wanneer hAECs worden geleverd aan de gewonde volwassen en neonatale long-, ze oefenen hun herstellende effecten via de modulatie van gastheer immuuncellen, het verminderen van pulmonale leukocyten werving, waaronder neutrofielen, macrofagen en lymfocyten 21-23.
Gezien hun overvloed,veiligheid record, en bewezen klinische toepassingen voor meerdere ziekten, klinische studies met behulp van hAECs is onvermijdelijk. Met als doel het versnellen van de vertaling van HAEC therapieën in de klinische-trials, ontwikkelden we methoden om te isoleren, cryopreserve en cultuur hAECs op een wijze die geschikt is voor klinische studies, met behulp van dierlijk product-vrije reagentia in overeenstemming met de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP) richtlijnen .
Dit protocol is gebaseerd een eerder gepubliceerde protocol dat we met succes werden gebruikt om hAECs te isoleren met behulp van dierlijke reagentia 6. We veranderde de oorspronkelijke protocol om dierlijke producten te vervangen door dierlijk product-vrije reagentia, en de daaropvolgende optimalisatie werd uitgevoerd om celopbrengst, levensvatbaarheid en zuiverheid te optimaliseren. Ons doel was om een protocol dat zou voldoen aan de wettelijke normen voor mobiele productie voor menselijke klinische proeven te ontwikkelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn een aantal kritische parameters die een aanzienlijke invloed op het succes van deze methode kan hebben. Opslag van de placenta of amnion tot 3 uur voor isolatie van hAECs wenselijk logistieke planning of doeleinden, maar het wordt aanbevolen dat de weefsels zo snel mogelijk verwerkt. Als weefsel moet worden opgeslagen, is het raadzaam dat de opslag worden uitgevoerd na dissectie en wassen van de amnion membraan. Amnion kunnen worden opgeslagen in steriele HBSS dat antibiotica bij 4 ° C, maar cellevensvatbaarhei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Protective Apparel | |||
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. . Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. . Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).
