Isolasjon, Kryopreservering og kultur menneskerettighets amnion Epitelceller for kliniske anvendelser

Summary

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Abstract

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.

hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.

We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

Introduction

Celler avledet fra perinatale kilder, for eksempel morkaken, morkake membraner, navlestreng og fostervann har tiltrukket seg oppmerksomhet fra forskere og klinikere som en potensiell kilde til celler for regenerativ medisin ^1,2. Årsaken til denne interessen er at disse celletyper alle har en viss grad av plastisitet og immunmodulerende evne ^3, egenskaper som er avgjørende for deres potensielle terapeutiske anvendelser.

hAECs er en heterogen populasjon epitel som kan være avledet fra sikt eller pre-term amnion membran ^4, som gir en rikelig potensiell kilde til regenerativ cellemateriale. De egenskapene som gjør hAECs tiltalende som en mobil terapi inkluderer deres multipotency, lav immunogenisitet, og anti-inflammatoriske egenskaper. hAECs har blitt funnet å være meget multipotent både in vitro og in vivo, er i stand til å differensiere til mesodermal linjene (cardiomyocytes, myocytes, osteocytter, adipocytter), endodermal linjene (bukspyttkjertelen celler, leverceller, lungeceller) og ectodermal linjene (hår, hud, nerveceller og astrocytter) ^5-10.

Betryggende, til tross for sine multipotency hAECs ikke synes å enten skjema svulster eller fremme svulst utvikling in vivo. Videre hAECs er også immune privilegert, uttrykker lave nivåer av klasse II menneskelige leukocyttantigener (HLAs) ^8. Denne egenskapen sannsynlig ligger bak deres evne til å unngå immun avvisning etter allogen og xenogen transplantasjon, som demonstrert i studier med immun kompetente aper, kaniner, marsvin, rotter og griser ^11-13. hAECs vise potent immunmodulerende og immunsupprimerende egenskaper og dermed gi betydelige praktiske fordeler for potensielle kliniske anvendelser i autoimmun sykdom terapi. hAECs antas å utøve immunmodulerende funksjoner på både medfødte og ervervede immunforsvar. Påe av mekanismene foreslåtte, er gjennom utskillelsen av immunmodulerende faktorer ^14.

Nåværende anvendelser av hAECs i prekliniske dyresykdomsmodeller inkluderer behandling av hjerneslag, multippel sklerose, leversykdom, diabetes og kroniske og akutte lungesykdommer. Forskere har vist interesse for å bruke hAECs å behandle post-takts hjernebetennelse på grunn av sine unike egenskaper. Det er dokumentert at hAECs kan krysse blod-hjerne barrieren der de kan innpode, overleve i opptil 60 dager, differensiere i nevroner, redusere betennelse og fremme regenerering av skadet sentralnervesystemet vev i dyremodeller av nevrologiske sykdommer ^15.

hAECs tilbyr muligheten til å målrette og reversere flere patologiske pathways som bidrar til utvikling og progresjon av multippel sklerose. For eksempel resultater fra prekliniske dyrestudier tyder på at hAECs er sterkt immundempende ogkan potensielt indusere perifer immuntoleranse og reversere pågående betennelsesreaksjoner. hAECs har også vist seg å ha kapasitet til å differensiere i nerveceller in vivo og forbedre endogen neuroregeneration gjennom utskillelsen av et stort utvalg av neurotrof faktorer ^16.

Humane og gnager amnion epitelceller har allerede demonstrert deres terapeutiske effekt ved behandling av leversykdom hos dyremodeller. I en karbontetraklorid skade induksjon modell av leversykdom, HAEC transplantasjon fører til innpoding av levedyktige hAECs i leveren, sammen med redusert hepatocytter apoptose, og redusert hepatisk inflammasjon og fibrose ^17.

hAECs kan stimuleres til uttrykt i bukspyttkjertelen faktorer, inkludert insulin og glukose transportører. Flere studier har undersøkt muligheten for hAECs å gjenopprette blodglukosenivåer i diabetiker mus ^18. I mus som mottokhAECs, både dyr kroppsvekt og blodsukker redusert til normale nivåer etter injeksjon av celler. Disse studiene presentere en sterk sak for bruk av hAECs for behandling av diabetes mellitus.

hAECs har en bevist rolle i forebygging og reparasjon av eksperimentell akutt og kronisk lungeskade både voksne og neonatale modeller ^19. Disse studiene fant at hAECs skille in vitro til funksjonell lunge epitelceller uttrykker flere lunge-assosiert proteiner, inkludert Cystisk fibrose transmembran Conductance Regulator (CFTR), ion-kanalen som er mutert hos pasienter med cystisk fibrose ^20. I tillegg, når hAECs blir levert til den skadde voksen og neonatal lunge, utøver de sin reparerende virkninger via modulering av vertsimmunceller, redusere lunge leukocytt-rekruttering, inkludert neutrofiler, makrofager og lymfocytter ^21-23.

Gitt sin overflod,sikkerhet posten, og påvist kliniske applikasjoner for flere sykdommer, kliniske forsøk med hAECs er uunngåelig. Med mål om å fremskynde oversettelse av HAEC behandlinger i kliniske-studier, har vi utviklet metoder for å isolere, fryse ned og kultur hAECs på en måte som er egnet for kliniske studier, ved hjelp av animalske produkt-free reagenser i samsvar med gjeldende Good Manufacturing Practices (cGMP) retningslinjer .

Vi baserte denne protokollen en tidligere utgitt protokoll som vi brukte med hell for å isolere hAECs bruker animalske reagenser ^6. Vi endret den opprinnelige protokollen for å erstatte animalske produkter med dyreproduktfritt reagenser, og påfølgende optimalisering ble utført for å optimalisere celleutbytte, levedyktighet og renhet. Vårt mål var å utvikle en protokoll som ville være i samsvar med regelverkets krav til celle produksjon for kliniske studier.

Protocol

MERK: morkaker skal samles fra Singleton sunt svangerskap, med en preferanse for langtids elektive keisersnitt. Skrevet, bør informert samtykke gis for innsamling av sin morkake. Din relevant menneskelige forskningsetisk komité bør godkjenning all innsamling og bruk av menneskelig vev. 1. Isolering av amnion Epitelceller Plasser morkaken på en steril overflate i en klasse II biologisk sikkerhetskabinett. Ved hjelp av sterile Hanks balansert…

Representative Results

Når denne fremgangsmåte følges fullstendig, bør en gjennomsnittlig utbytte på 120 millioner hAECs være forventet, med et typisk område på fra 80 til 160 millioner celler. Fra disse utbytter, kan forventes en gjennomsnittlig levedyktigheten til 83 ± 4%. Den økede gjennomsnittlig utbytte og litt lavere levedyktigheten i klinisk metode kan skyldes høyere trypsin-aktivitet enn animalsk-avledede produkt, og kanskje også på grunn av mangel av serumproteiner. Isolerte hAECs har en gjennomsnittlig celleoverflatepro…

Discussion

Det er flere viktige parametere som kan ha en betydelig innvirkning på suksessen av denne metodikken. Lagring av morkaken eller amnion i opp til 3 timer før isolering av hAECs kan være ønskelig for logistikk eller planleggingsformål, men det anbefales at vevet er behandlet så snart som mulig. Hvis vevet skal lagres, er det anbefalt at lagring kan utføres etter disseksjon og vasking av amnion membran. Amnion kan lagres i sterile HBSS inneholdende antibiotika ved 4 ° C, men kan redusere cellenes levedyktighet med …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Collection Kit
Stripping tray	Fisher Scientific	13-361B
Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm	Fisher Scientific	S17329
Scissors – Sharp/Blunt Straight	Fisher Scientific	NC0562592
Sterile latex gloves	Fisher Scientific	19-014-643
Protective Apparel (Gown)	U-line	S-15374-M
Protective Apparel
Isolation gowns	U-line	S-15374-M
Sterile latex gloves	Fisher Scientific	19-014-643
General purpose face mask	Cardinal Health	AT7511
Bonnets	Medline	CRI1001
Shoe covers	U-line	S-7873W
Media and Reagents
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Life Technologies	14175095	without calcium or magnesium
TrypZean(animal product–free recombinant trypsin)	Sigma Aldrich	T3449
Soybean Trypsin Inhibitor  1g/50mL	Sigma Aldrich	T6522
Cryostor CS5	BioLife Solutions	205102
Trypan blue reagent	Life Technologies	15250-061
anti-EpCam-PE	Miltenyi Biotec	130 – 091-253
PE-isotype control	Miltenyi Biotec	130-098-845
anti-CD90-PeCy5	BD Pharmingen	555597
PeCy5-isotype control	BD Pharmingen	557224
anti-CD105-APC	BD Pharmingen	562408
APC-isotype control	BD Pharmingen	340754
Collagen Type VI	Sigma Aldrich	C7521
Consumables
50mL graduated pipette	BD/Falcon	356550
10mL graduated pipette	BD/Falcon	356551
5mL graduated pipette	BD/Falcon	356543
50mL falcon tubes	BD/Falcon	352070
15mL falcon tubes	BD/Falcon	352096
15-cm petri dishes	Corning	351058
70-μm filters	BD/Falcon	352350
0.22-μm filters	Millipore	SLGV033RS
1ml Pipette tips	Fisherbrand	02-707-401
200ul Pipette tips	Fisherbrand	02-707-409
20ml Syringe	BD/Medical	309661
Plastic spatula	Fisher Scientific	14-245-97
Plastic weighing boat	Fisher Scientific	02-202-102
Cryo vials	Nunc	377267
Equipment
Mr Frosty	Fisher Scientific	A451-4
Biohazard Cabinet