Isolering, Frysförvaring och kultur för mänskliga amnion epitelceller för kliniska tillämpningar
Summary
We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Abstract
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Introduction
Celler som härrör från perinatala källor, såsom moderkakan, placenta membran, navelsträng och fostervatten har väckt uppmärksamhet från forskare och kliniker som en potentiell källa till celler för regenerativ medicin 1,2. Anledningen till detta intresse är att dessa celltyper alla besitter en viss grad av plasticitet och immunmodulerande förmåga 3, egenskaper som är grundläggande för deras potentiella terapeutiska tillämpningar.
hAECs är en heterogen epitelial befolkning som kan härledas från termin eller prematur amnion membran 4, ger en riklig potentiell källa till regenerativ cellmaterial. De egenskaper som gör hAECs talande som en cellulär terapi inkludera deras multipotens, låg immunogenicitet, och anti-inflammatoriska egenskaper. hAECs har visat sig vara mycket multi både in vitro och in vivo, förmåga att differentiera till mesodermala härstamningar (cardiomyocytes, myocyter, osteocyter, adipocyter), endodermala härstamningar (pankreasceller, leverceller, lungceller) och ektodermala härstamningar (hår, hud, neurala celler och astrocyter) 5-10.
Betryggande, trots deras multipotens hAECs inte verkar antingen bilda tumörer eller främjar tumörutveckling in vivo. Dessutom hAECs är också immuna privilegierade, som uttrycker låga nivåer av klass II humana leukocytantigener (HLA) 8. Denna fastighet ligger bakom sannolikt deras förmåga att undgå immunavstötning efter allogen och xenogent transplantation, som visats i studier med immunkompetenta apor, kaniner, marsvin, råttor och grisar 11-13. hAECs visa potent immunmoduler och immunosuppressiva egenskaper och därmed erbjuda betydande praktiska fördelar för potentiella kliniska tillämpningar inom autoimmun sjukdom terapi. hAECs tros utöva immunomodulerande funktioner på både medfödda och adaptiva immunsystem. Påe av de mekanismer som föreslås, är genom utsöndring av immunmodulerfaktorer 14.
Aktuella tillämpningar av hAECs i prekliniska djurmodeller inkludera behandling av stroke, multipel skleros, leversjukdom, diabetes och kroniska och akuta lungsjukdomar. Forskare har visat intresse för att använda hAECs att behandla post-stroke hjärninflammation på grund av deras unika egenskaper. Det finns bevis för att hAECs kan passera blod-hjärnbarriären, där de kan ympas, överleva i upp till 60 dagar, differentiera till neuroner, minskar inflammation och främjar regenerering av skadad vävnad från centrala nervsystemet i djurmodeller av neurologiska sjukdomar 15.
hAECs erbjuder möjligheten att rikta och vända flera patologiska vägar som bidrar till utveckling och progression av multipel skleros. Till exempel, är ett resultat av prekliniska djurstudier tyder på att hAECs är starkt immunsuppressiv ochkan potentiellt inducera perifer immuntolerans och vända pågående inflammatoriska reaktioner. hAECs har också visat sig ha kapacitet att differentiera till neurala celler in vivo och öka endogen neuroregeneration genom utsöndring av ett brett spektrum av neurotrofa faktorer 16.
Mänskliga och gnagare amnion epitelceller har redan visat sin terapeutiska effekt vid behandling av leversjukdom i djurmodeller. I en koltetraklorid skador induktion modell av leversjukdom, HÅEC transplantation leder till inympning av livskraftiga hAECs i levern, tillsammans med minskad hepatocyte apoptos, och minskad leverinflammation och fibros 17.
hAECs kan stimuleras till uttryckta pankreas faktorer, inklusive insulin och glukostransportörer. Flera studier har undersökt potentialen för hAECs att återställa blodglukosnivåer i diabetiska möss 18. I möss som fickhAECs, både djurens kroppsvikt och blodglukosnivåerna sjunkit till normala nivåer efter injektion av celler. Dessa studier presentera starka argument för att använda hAECs för behandling av diabetes mellitus.
hAECs har en erkänd roll i förebyggande och reparation av experimentell akut och kronisk lungskada både vuxna och neonatala modellerna 19. Dessa studier fann att hAECs differentierar in vitro till funktionellt lungepitelceller som uttrycker multipla lungassocierade proteiner, inklusive cystisk fibros transmembran (CFTR), jonkanalen som är muterad i patienter med cystisk fibros 20. Dessutom, när hAECs levereras till den skadade vuxna och neonatal lunga, de utövar sina reparativa effekter via modulering av värdimmunceller, minskar lung leukocyter rekrytering, inklusive neutrofiler, makrofager och lymfocyter 21-23.
Med tanke på deras överflöd,säkerhetsstatistik och beprövade kliniska tillämpningar för flera sjukdomar, kliniska prövningar med hAECs är oundvikligt. Med målet att påskynda överföringen av HÅEC terapier i klinisk-prövningar utvecklade vi metoder för att isolera, cryopreserve och kultur hAECs på ett sätt som lämpar sig för kliniska prövningar, med hjälp av animalieprodukter fria reagenser i enlighet med gällande god tillverkningssed (cGMP) riktlinjer .
Vi bygger detta protokoll en tidigare publicerad protokoll som vi använde framgångsrikt för att isolera hAECs använder animaliska reagenser 6. Vi ändrade det ursprungliga protokollet att ersätta animaliska produkter med animaliskt produktfria reagenser, och efterföljande optimering utfördes för att optimera cellutbyte, livskraft och renhet. Vårt mål var att utveckla ett protokoll som skulle uppfylla de rättsliga normer för cell tillverkning för kliniska prövningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera kritiska parametrar som kan ha en betydande inverkan på framgången för denna metod. Förvaring av moderkakan eller amnion för upp till 3 timmar före isolering av hAECs kan vara önskvärt för logistiska eller schemaläggning ändamål, men det rekommenderas att vävnaden behandlas så snart som möjligt. Om vävnaden skall lagras, rekommenderas att lagring utföras efter dissektion och tvättning av amnion membranet. Amnion kan lagras i sterila HBSS innehållande antibiotika vid 4 ° C, men cellvia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Protective Apparel | |||
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. . Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. . Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).
