الهلام بولي أكريلاميد لInvadopodia وقوة الجر فحوصات على خلايا سرطان
Summary
صلابة الميكانيكية في المكروية الورم تلعب دورا حاسما في سلوك القيادة الخبيث من خلال زيادة النشاط invadopodia وأكتوميوزين انقباض. باستخدام المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة)، invadopodia وقوة الجر فحوصات يمكن استخدامها لدراسة خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية في الاستجابة إلى matrix صلابة.
Abstract
تم أنسجة الورم جامدة تورط بقوة في تنظيم الهجرة الخلايا السرطانية والغزو. الهجرة الغازية من خلال الأنسجة عبر ربط وتيسره نتوءات الأكتين الغنية دعا invadopodia التي تحط proteolytically المصفوفة خارج الخلية (ECM). وقد تبين النشاط Invadopodia أن تعتمد على صلابة ECM وسرطان الخلايا مقلص القوات مما يوحي بأن إشارات صلابة يمكن تنظيم هذه الهياكل التحت خلوية من خلال أكتوميوزين انقباض. خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية يمكن ربط في المختبر باستخدام فحوصات invadopodia وقوة الجر بناء على المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة) من الجمود مختلفة. خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية يمكن ربط في المختبر باستخدام فحوصات invadopodia وقوة الجر بناء على المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة) من الجمود مختلفة. ورغم وجود بعض الاختلافات بين المقايسات، وهما بروتوكول المعروضة هنا يوفر وسيلة لخلق أجزاء من الكميات المخصصة عشرفي ويمكن أن تستخدم في كل من المقايسات ويسهل قابلة للتكيف مع الاحتياجات البيولوجية وتقنية محددة للمستخدم.
Introduction
وقد تم التعرف على صلابة من ECM-المرتبطة ورم باعتبارها عاملا هاما في سلوك القيادة الخبيث من خلال زيادة أكتوميوزين انقباض 1-3. بينما في المقام الأول تجلى هذا التأثير مع خلايا سرطان الثدي، وقد وجد مصفوفة الصلابة لتغيير خصائص الغازية من الخلايا المشتقة من مجموعة متنوعة من السرطانات 4-8 مما يشير إلى أن صلابة الورم قد تلعب دورا في نوع آخر من أنواع السرطان. على اختراق الأنسجة عبر وصلات هنا خلال الهجرة الغازية، وسرطان الخلايا تستخدم نتوءات الأكتين الغنية لاصقة المعروفة باسم invadopodia أن توطين proteinases أن تتحلل الوزراء البريطانى وECM 9. وتعتبر Invadopodia السمة المميزة للخلايا الغازية وقد تورطت في غزو الخلايا السرطانية وورم خبيث 10،11. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن مصفوفة الصلابة يمكن تنظيم أرقام invadopodia وما يرتبط بها من تدهور ECM 4،12 من خلال ميوسين II النشاط والبروتينات mechanosensitive 12. نظرا إلىالعلاقة بين كثافة الورم والسرطان العدوانية 13،14، وتشير هذه النتائج إلى الآلية التي الخلايا السرطانية قد يستجيب لأنسجة الورم جامدة لقيادة الغزو والانبثاث من خلال أكتوميوزين انقباض.
في المختبر ECM صلابة وكثافة الأنسجة في الجسم الحي وقد ثبت أن تنظيم السلوك الغازية من الخلايا السرطانية 1،15-17. في حين أكتوميوزين انقباض يبدو أن المهم في هذه العملية، والصراع الدراسات الحالية حول ما إذا كان يرتبط قدرة النقيلي إلى زيادة أو نقصان القوات مقلص 6،18-20. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت هذه القوات التوسط مباشرة النشاط invadopodia 21. لقد وجدنا مؤخرا أن القوات مقلص الخلايا السرطانية كانت تعتمد على مصفوفة الصلابة وكانت التنبؤية لتدهور ECM التي كتبها invadopodia 5. وتشير هذه النتائج إلى أن قوات الخلوية قد تلعب دورا هاما في تطور السرطان عن طريق التوسط invadopodia ميلانالناقلية ردا على الخواص الميكانيكية للالمكروية الورم.
من أجل ربط خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية 5، ونحن تعديل بروتوكول لإنشاء جزء من الكميات المسندة مع الجمود المختلفة التي كانت تستخدم سابقا للتحقيق التي تعتمد على الصلابة النشاط invadopodia 4،12،22. قبل يشابك كيميائيا فبرونيكتين بلازما الإنسان في جميع أنحاء جزء من الكميات المسندة، وهذه الهلاميات المائية المعدلة ويمكن استخدام كأساس لكلا invadopodia والمقايسات قوة الجر لضمان أن الخلايا شهدت نفس الجمود في كلا التجربتين 5. في المقايسات invadopodia، توفر فبرونيكتين مجال ملزم الطبيعي لالجيلاتين لربط ECM مضافين إلى أجزاء من الكميات المخصصة للكشف عن تدهور المصفوفة. في المقايسات قوة الجر، توفر فبرونيكتين ليجند للالتصاق الخلوي المباشر للكشف عن نزوح المكروية المستخدمة لحساب قوات الجر الخلوية. هذه النتائج الأسلوب في ما طالبنا لينة، من الصعب،وجزء من الكميات المسندة الجامدة التي لا بد أن أطباق أسفل الزجاج ولها معاملات الرجوعية المرنة، E، من 1،023، 7،307، و22692 با 5 التي تغطي مجموعة من الخواص الميكانيكية وذكرت لالأنسجة الطبيعية والسرطانية 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
ونحن نقدم وسيلة لافتعال أجزاء من الكميات المخصصة التي يمكن استخدامها كأساس لinvadopodia وقوة الجر المقايسات لربط السلوكيات الخلوية الغازية ومقلص. بينما جزء من الكميات المسندة منذ فترة طويلة تستخدم للنظر في الآثار صلابة على الخلايا وحساب القوات الجر 18،24،27، وهذا ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
| goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
| mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
| sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |
References
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
- Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
- Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
- Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
- Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
- Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
- Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
- Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
- Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
- Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
- Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
- Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A., Coutts, A. S. . Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. 1046, 171-189 (2013).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
- Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
- Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
- Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).
