Los geles de poliacrilamida para invadopodios y Fuerza de tracción Ensayos sobre las células cancerosas
Summary
Rigidez mecánica en el microambiente tumoral juega un papel fundamental en el impulso de comportamiento maligno mediante el aumento de la actividad invadopodios y actomyosin contractilidad. Geles de poliacrilamida utilizando (PaaS), ensayos de invadopodios y de la fuerza de tracción se pueden utilizar para estudiar las propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas en respuesta a la matriz rigidez.
Abstract
Tejidos tumorales rígidos han sido fuertemente implicados en la regulación de la migración celular y la invasión del cáncer. La migración invasiva a través de tejidos reticulados se ve facilitada por los salientes de actina-ricos llamados invadopodios que proteolíticamente degradan la matriz extracelular (ECM). Actividad invadopodios ha demostrado ser dependiente de la rigidez ECM y célula de cáncer de fuerzas contráctiles que sugieren que las señales de rigidez pueden regular estas estructuras subcelulares a través de la contractilidad actomiosina. Propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas pueden ser correlacionados in vitro utilizando ensayos invadopodios y de la fuerza de tracción sobre la base de geles de poliacrilamida (PAA) de diferentes rigideces. Propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas pueden ser correlacionados in vitro utilizando ensayos invadopodios y de la fuerza de tracción sobre la base de geles de poliacrilamida (PAA) de diferentes rigideces. Aunque existen algunas variaciones entre los dos ensayos, el protocolo presentado aquí proporciona un método para crear FCA ésimoa se puede utilizar en ambos ensayos y son fácilmente adaptables a las necesidades biológicas y técnicas específicas de los usuarios.
Introduction
La rigidez de la ECM asociado al tumor ha sido identificado como un factor significativo en la conducción de comportamiento maligno mediante el aumento de la contractilidad actomyosin 1-3. Mientras que este efecto se ha demostrado principalmente con células de cáncer de mama, la rigidez de la matriz se ha encontrado para alterar las propiedades invasivas de las células derivadas de una variedad de cánceres 4-8 lo que sugiere que la rigidez tumor pueden desempeñar un papel en otro tipo de cánceres. Para penetrar en los tejidos entrecruzados durante la migración invasivo, las células cancerosas utilizan protuberancias adhesivas actina-ricos conocidos como invadopodios que localizar proteinasas para degradar focalmente el ECM 9. Invadopodios se consideran una característica de las células invasoras y han sido implicados en la invasión de células tumorales y la metástasis 10,11. El trabajo previo ha mostrado que la rigidez de la matriz puede regular los números invadopodios y la degradación de ECM asociado 4,12 través de la miosina II actividad y proteínas mechanosensitive 12. Dado quecorrelación entre la densidad del tumor y la agresividad del cáncer 13,14, estos resultados sugieren un mecanismo por el cual las células cancerosas pueden responder a los tejidos tumorales rígidos para conducir la invasión y la metástasis a través de la contractilidad actomiosina.
En rigidez ECM vitro y en la densidad del tejido vivo se ha demostrado para regular el comportamiento invasivo de las células cancerosas 1,15-17. Mientras que la contractilidad actomyosin parece ser importante en este proceso, la corriente de conflicto estudios en cuanto a si la capacidad metastásica se correlaciona con aumento o disminución de las fuerzas contráctiles 6,18-20. Además, aún se desconoce si estas fuerzas median directamente la actividad invadopodios 21. Recientemente, hemos encontrado que las fuerzas contráctiles célula cancerosa dependían de la rigidez de la matriz y fueron predictivos de la degradación de ECM por invadopodios 5. Estos resultados sugieren que las fuerzas celulares pueden desempeñar un papel importante en la progresión del cáncer mediando invadopodios actividad en respuesta a las propiedades mecánicas del microambiente del tumor.
Para correlacionar propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas 5, modificamos un protocolo para la creación de FCA con diferentes rigideces que se utilizó anteriormente para investigar la actividad invadopodios rigidez dependiente 4,12,22. Por reticulación químicamente fibronectina plasmática humana en todo el FCA, estos hidrogeles modificados se pueden utilizar como la base para tanto invadopodios y los ensayos de fuerza de tracción para asegurar que las células experimentaron las mismas rigideces en ambos experimentos 5. En los ensayos de invadopodios, la fibronectina proporciona un dominio de unión natural para la gelatina para vincular el ECM superpuesto a la FCA para detectar degradación de la matriz. En los ensayos de fuerza de tracción, la fibronectina proporciona un ligando para la adhesión celular directa para detectar desplazamientos de microesferas utilizadas para calcular las fuerzas de tracción celulares. Este método resulta en lo que hemos llamado blando, duro,y PAA rígidos que están unidos a los platos con fondo de cristal y tienen módulos de elasticidad, E, de 1.023, 7.307 y 22.692 Pa 5 que abarcan la gama de propiedades mecánicas reportados para los tejidos normales y cancerosos 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un método para la fabricación de FCA que se pueden utilizar como la base para los ensayos de invadopodios y fuerza de tracción para correlacionar comportamientos celulares invasivas y contráctiles. Mientras FCA han sido utilizados para observar los efectos de rigidez en las células y calcular las fuerzas de tracción 18,24,27, este protocolo es el primero en desarrollar ensayos paralelos basados en APA con las mismas rigideces correlacionar comportamientos celulares invasivos y contrác…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
| goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
| mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
| sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |
References
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
- Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
- Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
- Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
- Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
- Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
- Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
- Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
- Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
- Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
- Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
- Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A., Coutts, A. S. . Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. 1046, 171-189 (2013).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
- Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
- Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
- Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).
