Tümörün mikro mekanik sertliği invadopodia aktivitesini artırarak ve kasılma actomyosin ile malign davranış sürüş önemli bir rol oynar. Kullanma poliakrilamid jelleri (PAAS) invadopodia ve çekiş kuvveti deneyleri bükülmezlik matris yanıt olarak kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini incelemek için kullanılabilir.
Katı tümör dokuları güçlü kanser hücresi göç ve istila düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Çapraz-bağlanmış dokular içinden invaziv göç proteolitik olarak hücre-dışı matrisi (ECM) indirgeme invadopodia adı aktin zengin uzantılar ile kolaylaştırılır. Invadopodia aktivitesi sertliği sinyalleri aktomizin kontraktilite yoluyla bu hücre içi yapıları düzenleyebildiğini göstermektedir ECM sertliği ve kanser hücresi kasılma kuvvetleri bağlı olduğu gösterilmiştir. Kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini farklı bükülmezliklerde poliakrilamid jeller (PAAS) göre invadopodia ve çekiş kuvveti testleri kullanılarak in vitro korele edilebilir. Kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini farklı bükülmezliklerde poliakrilamid jeller (PAAS) göre invadopodia ve çekiş kuvveti testleri kullanılarak in vitro korele edilebilir. İki tahliller arasında bazı farklılıklar vardır, ancak burada sunulan protokol inci PAAS oluşturmak için bir yöntem temin etmektedirHer iki deneylerinde kullanılabilir ve kolayca kullanıcının belirli bir biyolojik ve teknik ihtiyaçlarına adapte edilebilir edilebilir.
tümör ilişkili ECM sertliği aktomizin kasılma 1-3 artırarak malign davranış sürüş önemli bir faktör olarak tespit edilmiştir. Bu etki ilk olarak göğüs kanseri hücreleri ile gösterilmiştir, matris sertliği diğer kanser türü bir rol oynayabileceğini tümör sertliğini gösteren kanser 4-8 çeşitli türetilen hücre invaziv özelliklerini değiştirmek için bulunmuştur. Invaziv göç sırasında çapraz bağlı dokulara nüfuz etmek, kanser hücrelerinin fokal ECM 9 aşağılamak için proteinazı lokalize invadopodia olarak bilinen aktin-zengin yapışkan uzantıların kullanılması. Invadopodia invaziv hücrelerinin bir işareti olarak düşünülen ve tümör hücre istilası ve metastaz 10,11 implike edilmiştir. Önceki çalışma matris sertlik invadopodia numaralarını düzenleyen göstermiştir ve miyozin II faaliyet ve mechanosensitive proteinler 12 ile ECM bozulmasını 4,12 ilişkili olmuştur. VerilmişTümör yoğunluğu ve kanser saldırganlık 13,14 arasındaki korelasyon, bu sonuçlar kanser hücrelerinin aktomizin kontraktilitesinde yoluyla işgali ve metastaz sürücü sert tümör dokularına yanıt verebilir bir mekanizma öneririz.
Nitro ECM sertlik ve in vivo doku yoğunluğunun kanser hücrelerinin 1,15-17 invaziv davranışını düzenleyen gösterilmiştir. Aktomizin kontraktilite, bu süreçte önemli görünmektedir iken, metastatik kapasite artışı ile ilişkilendirilmiştir ya da kasılma kuvvetleri 6,18-20 azalma olup olmadığı gibi mevcut çalışmalar çatışma. Ayrıca, bu güçlerin doğrudan invadopodia aktivitesini 21 arabuluculuk olmadığını bilinmemektedir. Biz son zamanlarda kanser hücresi kasılma kuvvetleri matris sertlik bağımlı ve invadopodia 5 ile ECM bozulma belirleyici olduğunu buldu. Bu sonuçlar hücresel kuvvetler invadopodia ac aracılık kanser ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedirtümör mikro-mekanik özelliklerine yanıt olarak bilirlik.
Kanser hücrelerinin 5 invaziv ve kasılma özelliklerini ilişkilendirilmesi için, daha önceden sertliği bağımlı invadopodia aktivitesi 4,12,22 araştırmak için kullanılmıştır, farklı sertliklere sahip PAAS oluşturmak için bir protokol yapılması. Kimyasal PAAS boyunca insan plazma fibronektinin çapraz olarak, bu modifiye edilmiş hidrojeller hücreler iki deneyde 5 aynı katılıkları deneyimli sağlamak için invadopodia ve çekiş kuvveti deneyleri hem de baz olarak kullanılabilir. Invadopodia deneylerinde, fibronektin matris bozulmasını tespit PAAS için Kaplanmış ECM bağlantı jelatin bir doğal bağlanma alanı içerir. Çekiş kuvveti deneylerinde, fibronektin hücresel çekiş kuvvetleri hesaplamak için kullanılan mikroküreli değiştirmeleri tespit doğrudan hücresel yapışma için bir ligand sağlar. Biz sert, yumuşak adlandırdıkları Bu yöntem sonuçları,normal ve kanserli dokuların 23 rapor mekanik özelliklerinin aralığını kapsayan hangi Pa 5 1023, 7307, ve 22.692 arasında, cam alt yemekleri bağlı ve elastik modüle, E sahiptir sert PAAS.
Bu invaziv ve kontraktil hücresel davranış ilişkilendirmek için invadopodia ve çekiş kuvveti testleri için temel olarak kullanılabilir PAAS imal edilmesi için bir yöntem sunulmaktadır. PAAS, hücrelerin üzerindeki sertlik etkilerine bakmak ve çekme kuvvetlerinin 18,24,27 hesaplamak için kullanılmış olsa da, bu protokol matrise karşılık invazif ve kontraktil hücresel davranışları ilişkili aynı bükülmezliklerde PAAS göre paralel analiz geliştirme ilk mekanik özellikleri. Düzgün…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |