Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.
Tessuti tumorali rigidi sono stati fortemente implicati nella regolazione della migrazione delle cellule del cancro e l'invasione. Migrazione invasiva attraverso i tessuti reticolati è facilitato da sporgenze ricchi di actina chiamati Invadopodi che proteoliticamente degradano la matrice extracellulare (ECM). Attività Invadopodi ha dimostrato di essere dipendente da rigidità ECM e il cancro delle cellule contrattili forze che suggeriscono che i segnali di rigidità possono regolare queste strutture subcellulari attraverso actomiosina contrattilità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Mentre esistono delle differenze tra i due test, il protocollo qui presentata fornisce un metodo per la creazione di PAA thin può essere utilizzato in entrambi i test e sono facilmente adattabili alle esigenze biologiche e tecniche specifiche dell'utente.
La rigidità del ECM associati al tumore è stato identificato come un fattore significativo nel determinare comportamenti maligni aumentando actomiosina contrattilità 1-3. Anche se questo effetto è stato dimostrato soprattutto con le cellule del cancro al seno, la rigidità matrice è stato trovato per modificare le proprietà invasive di cellule derivate da una varietà di tumori 4-8 che suggeriscono che la rigidità del tumore può svolgere un ruolo in altri tipi di tumori. Per penetrare i tessuti reticolati durante la migrazione invasivo, le cellule tumorali utilizzano sporgenze adesive ricche di actina conosciuti come Invadopodi che localizzare proteasi a degradare focally ECM 9. Invadopodi sono considerati un segno distintivo di cellule invasive e sono stati implicati in invasione delle cellule tumorali e metastasi 10,11. Il lavoro precedente ha mostrato che la rigidità matrice può regolare numeri Invadopodi e associati ECM degrado 4,12 attraverso l'attività miosina II e proteine meccanosensibili 12. Dato checorrelazione tra la densità del tumore e cancro aggressività 13,14, questi risultati suggeriscono un meccanismo attraverso il quale le cellule tumorali possono rispondere ai tessuti tumorali rigidi guidare invasione e metastasi attraverso actomiosina contrattilità.
In vitro rigidità ECM e nella densità del tessuto vivo hanno dimostrato di regolare il comportamento invasivo delle cellule tumorali 1,15-17. Mentre actomiosina contrattilità sembra essere importante in questo processo, gli studi in corso il conflitto come se la capacità metastatica è correlata ad un aumento o diminuzione forze contrattili 6,18-20. Inoltre, resta noto se queste forze mediare direttamente l'attività Invadopodi 21. Abbiamo recentemente scoperto che le forze contrattili cellula tumorale dipendevano rigidità matrice ed erano predittivi di ECM degrado da Invadopodi 5. Questi risultati suggeriscono che le forze cellulari possono svolgere un ruolo importante nella progressione del cancro mediando Invadopodi actività in risposta alle proprietà meccaniche del microambiente tumorale.
Al fine di correlare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali 5, abbiamo modificato un protocollo per la creazione di ZAP con differenti rigidità precedentemente utilizzati per studiare l'attività Invadopodi rigidità-dipendente 4,12,22. Con reticolazione chimica fibronectina plasma umano durante ZAP, questi idrogel modificati possono essere utilizzate come base per entrambi Invadopodi e forza di trazione saggi per assicurare che le cellule sperimentato le stesse rigidità in entrambi gli esperimenti 5. Nei saggi Invadopodi, la fibronectina fornisce un dominio di legame naturale per la gelatina di collegare la ECM sovrapposto alla ZAP per rilevare degradazione della matrice. Nei saggi di forza di trazione, la fibronectina fornisce un ligando per adesione cellulare diretta per rilevare spostamenti microsfere utilizzate per calcolare le forze di trazione cellulari. Questo metodo comporta quello che abbiamo chiamato morbido, duro,e CPA rigidi che sono legati ai piatti fondo di vetro e hanno moduli elastici, E, di 1.023, 7.307, e 22.692 Pa 5 che abbracciano la gamma di proprietà meccaniche segnalate per i tessuti normali e tumorali 23.
Vi presentiamo un metodo per la fabbricazione di PAA che possono essere utilizzati come base per Invadopodi e forza di trazione saggi di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili. Mentre CPA sono stati a lungo utilizzati per osservare gli effetti sulle cellule rigidità e calcolare le forze di trazione 18,24,27, questo protocollo è il primo a sviluppare test paralleli basati su CPA con le stesse rigidità di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili in risposta alla matrice …
The authors have nothing to disclose.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |