Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen
Summary
Mechanische stijfheid in de tumor micro-omgeving speelt een cruciale rol in het besturen van kwaadaardige gedrag door het verhogen van invadopodia activiteit en actomyosine contractiliteit. Met polyacrylamidegels (PTA) kunnen invadopodia en trekkracht assays worden gebruikt om de invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen in reactie op stijfheid matrix.
Abstract
Vaste tumorweefsels zijn sterk betrokken bij het reguleren kankercelmigratie en invasie. Invasieve migratie door middel van cross-linked weefsels wordt vergemakkelijkt door actine-rijke uitsteeksels genaamd invadopodia dat proteolytisch degraderen de extracellulaire matrix (ECM). Invadopodia activiteit is aangetoond afhankelijk ECM stijfheid en kankercellijnen contractiele krachten suggereert dat stijfheid signalen die subcellulaire structuren kunnen reguleren door actomyosine contractiliteit te zijn. Invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen kan worden gecorreleerd in vitro gebruik invadopodia en trekkracht assays gebaseerd op polyacrylamidegelen (PTA) van verschillende rigiditeiten. Invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen kan worden gecorreleerd in vitro gebruik invadopodia en trekkracht assays gebaseerd op polyacrylamidegelen (PTA) van verschillende rigiditeiten. Sommige verschillen tussen de twee tests bestaan, het protocol hier gepresenteerde een werkwijze voor het maken PAAs thbij kan in beide testen en gemakkelijk aanpasbaar aan specifieke biologische en technische behoeften van de gebruiker.
Introduction
De stijfheid van het tumor geassocieerde ECM is geïdentificeerd als een belangrijke factor bij het stimuleren maligne gedrag verhogen actomyosine contractiliteit 1-3. Hoewel dit effect voornamelijk aangetoond met borstkankercellen werd matrix stijfheid gebleken invasieve eigenschappen van cellen afkomstig van verschillende kankers 4-8 suggereert dat tumor stijfheid kan een rol spelen bij andere kankersoorten veranderen. Om verknoopte weefsels tijdens invasieve migratie dringen, kankercellen gebruiken actine-rijke lijm uitsteeksels bekend als invadopodia dat proteinases lokaal te maken focaal degraderen de ECM 9. Invadopodia worden beschouwd als een kenmerk van invasieve cellen en zijn betrokken bij tumorcel invasie en metastase 10,11. Vorige werk heeft aangetoond dat matrix stijfheid invadopodia nummers kunnen reguleren en bijbehorende ECM degradatie 4,12 door myosine II activiteit en mechanosensitieve eiwitten 12. Gezien decorrelatie tussen dichtheid en kanker tumor agressiviteit 13,14 suggereren deze resultaten een mechanisme waardoor kankercellen reageren stijve tumorweefsels invasie en metastase rijden door actomyosine contractiliteit.
In vitro ECM stijfheid en in vivo weefseldichtheid is aangetoond dat invasieve gedrag van kankercellen 1,15-17 reguleren. Terwijl actomyosine contractiliteit blijkt belangrijk te zijn in dit proces, bestaande studies conflict of metastatische capaciteit gecorreleerd verhoogde of verlaagde contractiele krachten 6,18-20. Bovendien is het nog onbekend of deze krachten rechtstreeks bemiddelen invadopodia activiteit 21. We ontdekten recent dat kankercel contractiele krachten waren afhankelijk van matrix stijfheid en waren voorspellend voor ECM afbraak door invadopodia 5. Deze resultaten suggereren dat cellulaire krachten een belangrijke rol in de progressie van kanker kunnen spelen door te bemiddelen invadopodia activiteit in reactie op de mechanische eigenschappen van de tumor micro-omgeving.
Om invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen 5 correleren, we aangepast een protocol voor het creëren van PTA's met verschillende rigiditeiten die eerder werd gebruikt om de stijfheid-afhankelijke invadopodia activiteit 4,12,22 onderzoeken. Door chemisch verknopen menselijk plasma fibronectine gehele PAAs, kunnen deze gemodificeerde hydrogelen worden gebruikt als basis voor zowel invadopodia en trekkracht testen om te waarborgen dat cellen ervoer dezelfde starre beide experimenten 5. In de invadopodia assays, de fibronectine zorgt voor een natuurlijke bindende domein voor gelatine om de overlay ECM koppelen aan de PTA's te matrixafbraak detecteren. In de trekkracht assays, de fibronectine verschaft een ligand voor directe cellulaire adhesie microsferen verplaatsingen gebruikt om cellulaire aandrijfkrachten berekenen detecteren. Deze methode resulteert in wat wij zacht, hard hebben genoemd,en stijf PTA's die zijn gebonden aan glazen bodem gerechten en hebben elasticiteitsmoduli, E, van 1.023, 7.307 en 22.692 Pa 5, die het bereik van de mechanische eigenschappen gemeld voor de normale en kankerweefsel 23 overspannen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We presenteren een werkwijze voor het vervaardigen PTA die kunnen worden gebruikt als basis voor invadopodia en trekkracht assays invasieve en contractiele cellulaire gedrag correleren. Terwijl PTA zijn lang gebruikt om te kijken naar stijfheid effecten op cellen en bereken trekkrachten 18,24,27, dit protocol is de eerste parallelle assays op basis PTA dezelfde starheid ontwikkelen invasieve en contractiele cellulaire gedrag correleren reactie op matrix mechanische eigenschappen. Goed activeren van de dekglaa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
| goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
| mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
| sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |
References
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
- Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
- Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
- Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
- Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
- Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
- Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
- Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
- Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
- Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
- Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
- Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A., Coutts, A. S. . Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. 1046, 171-189 (2013).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
- Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
- Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
- Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).
