gels de polyacrylamide pour invadopodes et la force de traction Les essais sur les cellules cancéreuses

Summary

Rigidité mécanique dans le microenvironnement de la tumeur joue un rôle crucial dans la conduite de comportement malin en augmentant l'activité de invadopodes et contractilité actomyosin. En utilisant des gels de polyacrylamide (PaaS), invadopodes et de force de traction tests peuvent être utilisés pour étudier les propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses en réponse à la matrice de rigidité.

Abstract

Tissus tumoraux rigides ont été fortement impliqué dans la régulation de la migration cellulaire et l'invasion du cancer. La migration invasive à travers les tissus réticulés est facilitée par des saillies d'actine riches appelés invadopodes qui dégradent protéolytique la matrice extracellulaire (ECM). invadopodes activité a été démontré que la rigidité dépendante de l'ECM et des cellules cancéreuses ce qui suggère que les forces de contraction des signaux de rigidité peuvent réguler ces structures sous-cellulaires à travers actomyosine contractilité. Propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses peuvent être corrélées in vitro en utilisant des tests de invadopodes et de la force de traction basés sur des gels de polyacrylamide (PaaS) de rigidités différentes. Propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses peuvent être corrélées in vitro en utilisant des tests de invadopodes et de la force de traction basés sur des gels de polyacrylamide (PaaS) de rigidités différentes. Bien qu'il existe quelques différences entre les deux essais, le protocole présenté ici fournit un procédé pour créer FQA eà peut être utilisé dans les deux essais et sont facilement adaptables aux besoins biologiques et techniques spécifiques de l'utilisateur.

Introduction

La rigidité de l'ECM associé à une tumeur a été identifiée comme un facteur important dans la conduite de comportement malin en augmentant la contractilité actomyosine ^1-3. Bien que cet effet a principalement été mise en évidence avec des cellules de cancer du sein, de la matrice de rigidité se est avérée modifier les propriétés invasives de cellules dérivées d'une variété de cancers ^08.04 suggérant que la rigidité de la tumeur peut jouer un rôle dans d'autres types de cancers. Pour pénétrer les tissus réticulés pendant la migration invasive, les cellules cancéreuses utilisent saillies adhésives actine riches appelés invadopodes que localiser protéases pour dégrader focalement l'ECM ^neuf. Invadopodes sont considérées comme une caractéristique de cellules invasives et ont été impliqués dans l'invasion des cellules tumorales et des métastases ^10,11. Des travaux antérieurs ont montré que la matrice de rigidité peut réguler numéros de invadopodes et la dégradation de l'ECM ^4,12 associée par l'activité myosine II et protéines mécanosensibles ^12. Compte tenu ducorrélation entre la densité de la tumeur et l'agressivité du cancer ^13,14, ces résultats suggèrent un mécanisme par lequel les cellules cancéreuses peuvent répondre aux tissus tumoraux rigides à conduire invasion et métastases travers contractilité actomyosin.

Il a été démontré in vitro ECM rigidité et de la densité des tissus in vivo pour réglementer le comportement invasif des cellules cancéreuses ^1,15-17. Alors que actomyosine contractilité semble être important dans ce processus, les études actuelles conflit quant à savoir si la capacité métastatique est corrélée à une augmentation ou diminution de forces contractiles ^6,18-20. En outre, il ne sait pas si ces forces médiation directement l'activité de invadopodes ^21. Nous avons récemment découvert que les forces de contraction des cellules cancéreuses étaient dépendants de la rigidité et la matrice étaient prédictifs de dégradation ECM par invadopodes ^5. Ces résultats suggèrent que les forces cellulaires peuvent jouer un rôle important dans la progression du cancer par la médiation invadopodes activité en réponse aux propriétés mécaniques du micro-environnement de la tumeur.

Afin de corréler propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses ^5, nous avons modifié un protocole pour la création de PAA avec différentes rigidités qui a été précédemment utilisés pour enquêter sur les activités de invadopodes rigidité dépendante ^4,12,22. Par réticulation chimique de la fibronectine de plasma humain à travers le FQA, ces hydrogels modifiés peuvent être utilisés comme base pour les deux dosages invadopodes et des forces de traction afin de se assurer que les cellules ont subi les mêmes rigidités dans les deux expériences ^5. Dans les dosages de invadopodes, la fibronectine fournit un domaine de liaison naturel pour la gélatine pour lier l'ECM superposée à l'AAP pour détecter la dégradation de la matrice. Dans les essais de la force de traction, la fibronectine fournit un ligand pour l'adhésion cellulaire direct à détecter des déplacements de microsphères utilisées dans le calcul des forces de traction cellulaires. Cette méthode aboutit à ce que nous avons appelé doux, dur,AAP et rigides qui sont liés à des plats à fond de verre et ont des modules élastiques, E, de 1023, 7307, et 22 692 Pa ⁵ qui couvrent la gamme de propriétés mécaniques rapportés pour les tissus normaux et cancéreux ^23.

Protocol

1. Préparation de verre Lamelles pour AAP Nettoyer les lamelles de 12 mm avec des lingettes charpie faibles. Flamme les lamelles de 12 mm et le 14 mm lamelle dans la cupule de chaque verre plat en bas de 35 mm en les faisant passer à travers une flamme du brûleur Bunsen l'aide de pinces. Traiter les micropuits avec 200 ul de NaOH 0,1 N pendant 5 min à température ambiante. Aspirer et l'air sec les puits pendant 30 min. Traiter les micropuits avec 50 à 100 …

Representative Results

Dans le test de invadopodes, invadopodes sont généralement identifié par colocalisation des marqueurs comme l'actine et cortactine les structures ponctuées dans le corps cellulaire (figure 1). Les deux invadopodes dégrader activement et non dégradantes peut être compté et se différencient par le fait que ces structures sont colocalisés avec des zones dépourvues de noir dans le signal fluorescent fibronectine marqué au FITC (figure 1). Invadopodes sont comptées manuellem…

Discussion

Nous présentons une méthode pour fabriquer AAP qui peuvent être utilisés comme base pour invadopodes et de la force de traction des essais de corréler les comportements cellulaires invasives et contractiles. Alors que PAA ont longtemps été utilisés pour examiner les effets de rigidité sur les cellules et calculer les forces de traction ^18,24,27, ce protocole est le premier à développer des tests parallèles fondés sur PAA avec les mêmes rigidités de corréler les comportements cellulaires invasi…

Materials

3-Aminopropyltrimethoxysilane	Sigma-Aldrich	281778
Acrylamide (40%)	Bio-Rad	161-0140
Acrylic acid NHS ester	Sigma-Aldrich	A8060	prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin	Life Technologies	A22283	can also use rhodamine
Ammonium persulfate	Bio-Rad	161-0700	prepare fresh 10% solution in 1X PBS
Aqua Poly/Mount	Polysciences	18606	use six drops to fill microwells
BIS (2%)	Bio-Rad	161-0142
Bovine serum albumin	RPI	A30075	make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
dialysis tubing	Sigma-Aldrich	D9777	pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min
DMEM	Cellgro	10-013-CV	use to make invadopodia medium
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor	Life Technologies	PHG0311	use to make invadopodia medium
Ethanol	PHARMCO-AAPER	E200	dilute with ultrapure water to 70%
FBS	Thermo Scientific	SH30070.03	use to make invadopodia medium
FITC	Sigma-Aldrich	F7250	protect from light
Gelatin	Polysciences	00639	typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips)	MatTek	P35G-0-14-C	coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%)	Polysciences	01909	dilute with 1X PBS to 0.5%
goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody	Life Technologies	A21050
Human plasma fibronectin	Life Technologies	33016-015	add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4	EMD Millipore	PX-1565-1	use to make 10X PBS stock
mouse anti-cortactin 4F11 antibody	EMD Millipore	05-180
Na2HPO4	EMD Millipore	SX-0720-1	use to make 10X PBS stock
NaCl	RPI	S23020	use to make 10X PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N)	Sigma-Aldrich	S2770	dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum)	BD Biosciences	355500	use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde	Acros	416785000	typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile)	Cellgro	21-040-CV	use for cell culture
RPMI 1640	Cellgro	10-040-CV	use to make invadopodia medium
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS
sodium metaborate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	S0251	use to make borate buffer
Sucrose	RPI	S24060	typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED	Bio-Rad	161-0800
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046	make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining