Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen
Summary
Mechanische Steifigkeit in der Tumor-Mikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle bei der malignen Verhalten durch Erhöhung invadopodia Aktivität und Actomyosin Kontraktilität. Verwendung Polyacrylamidgelen (PAAs), kann invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, die invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in Reaktion zu untersuchen, um die Steifigkeit Matrix.
Abstract
Starre Tumorgewebe sind stark bei der Regulierung der Krebszelle Migration und Invasion verwickelt. Invasive Migration durch vernetzte Gewebe durch actin reichen Vorsprünge genannt invadopodia die proteolytisch die extrazelluläre Matrix (ECM) abzubauen erleichtert. Invadopodia Aktivität hat sich gezeigt, abhängig von ECM Steifigkeit und Krebszellenkontraktionskräfte darauf hindeutet, dass die Steifigkeit Signale können diese subzellulärer Strukturen durch Actomyosin Kontraktilität zu regeln sein. Invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in vitro mit invadopodia und Zugkraft-Assays auf Basis von Polyacrylamid-Gelen (PAAs) unterschiedlicher Steifigkeiten korreliert werden. Invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in vitro mit invadopodia und Zugkraft-Assays auf Basis von Polyacrylamid-Gelen (PAAs) unterschiedlicher Steifigkeiten korreliert werden. Während einige Unterschiede zwischen den beiden Tests bestehen, die hier vorgestellte Protokoll liefert ein Verfahren für die Erstellung PAAs thbei in beiden Tests verwendet werden und sind leicht an die spezifischen biologischen und technischen Anforderungen des Benutzers.
Introduction
Die Steifigkeit des Tumor-assoziierten ECM wurde als wichtiger Faktor bei der Fahrt malignem Verhalten durch Erhöhung Actomyosin Kontraktilität 1-3 identifiziert. Obwohl dieser Effekt hauptsächlich bei Brustkrebszellen gezeigt hat Matrixsteifigkeit wurde gefunden invasiven Eigenschaften von Zellen, die aus einer Vielzahl von Krebs 4-8 darauf hindeutet, dass Tumor Steifigkeit kann in anderen Arten von Krebs eine Rolle spielen abgeleitet verändern. Vernetzte Geweben während invasiver Migration dringen, Krebszellen zu verwenden Aktin reiche Klebstoff Vorsprünge als invadopodia die Proteinasen zu lokalisieren, um die ECM 9 fokal verschlechtern bekannt. Invadopodia werden als ein Markenzeichen der invasiven Zellen und in Tumorzellinvasion und Metastasierung 10,11 in Verbindung gebracht. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Matrix Steifigkeit invadopodia Zahlen zu regulieren und die damit verbundenen Abbau ECM 4,12 durch Myosin II-Aktivität und mechanosensitive Proteine 12. Angesichts derKorrelation zwischen Tumordichte und Krebs Aggressivität 13,14 legen diese Ergebnisse einen Mechanismus, durch den Krebszellen um starre Tumorgeweben zu antworten Invasion und Metastasierung durch Actomyosin Kontraktilität fahren.
In vitro ECM Steifigkeit und in vivo Gewebedichte wurde gezeigt, dass invasive Verhalten von Krebszellen 1,15-17 regulieren. Während Actomyosin Kontraktilität scheint wichtig zu sein in diesem Prozess, aktuelle Studien Konflikt, ob metastasiertem Fähigkeit korreliert erhöht oder verringert Kontraktionskräfte 6,18-20. Darüber hinaus bleibt es unbekannt, ob diese Kräfte direkt vermitteln invadopodia Aktivität 21. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass Krebszellen Kontraktionskräfte waren abhängig von Matrix Steifigkeit und waren prädiktiv für ECM Abbau durch invadopodia 5. Diese Ergebnisse legen nahe, dass zelluläre Kräfte können eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression durch Vermittlung invadopodia ac spielenvität als Reaktion auf die mechanischen Eigenschaften der Tumor-Mikroumgebung.
Um invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen 5 korrelieren, modifizierten wir ein Protokoll für die Erstellung von PAA mit unterschiedlichen Steifigkeiten, die früher verwendet wurde, um die Steifigkeit abhängige invadopodia Aktivität 4,12,22 zu untersuchen. Durch chemisch vernetzenden Humanplasmafibronektin gesamten PAAs können diese modifizierten Hydrogele als Grundlage sowohl für invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, um sicherzustellen, dass Zellen erfahren die gleichen Steifigkeiten in beiden Experimenten 5. In den invadopodia Tests bietet das Fibronektin eine natürliche Bindungsdomäne für Gelatine, die überlagerte ECM an die PAA verlinken auf Matrixabbau zu erkennen. In der Zugkraft Tests bietet das Fibronektin einen Liganden für direkte zelluläre Adhäsion an Mikrosphären Verschiebungen verwendet werden, um zelluläre Zugkräfte berechnen zu erkennen. Dieses Verfahren führt zu, was wir weich, hart genannt,und starre PAA, die auf Glasboden Gerichte gebunden sind und Elastizitätsmodul, E, der 1023, 7307 und 22.692 Pa 5, die den Bereich der mechanischen Eigenschaften für den normalen und Krebsgewebe 23 berichtet erstrecken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellen ein Verfahren zum Herstellen PAAs, die als Grundlage für invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden kann, invasiv und kontraktilen zelluläre Verhalten korrelieren. Während PAAs seit langem verwendet, um an Steifigkeit Wirkungen auf Zellen und berechnet die Zugkräfte 18,24,27 ist dieses Protokoll das erste parallele Assays, die auf PAAs mit den gleichen Steifigkeiten zu entwickeln, die das Vordringen kontraktilen Zellverhalten in Reaktion auf Matrix korrelieren mechanische Eigenschaften. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
| goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
| mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
| sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |
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