Polyakrylamidgeler for Invadopodia og Trækkraft Analyser på kræftceller
Summary
Mekanisk stivhed i tumormikromiljøet spiller en afgørende rolle som drivkraft malign adfærd ved at øge invadopodia aktivitet og actomyosin kontraktilitet. Brug polyacrylamidgeler (cloud) kan invadopodia og trækkraft assays anvendes til at undersøge de invasive og kontraktile egenskaber cancerceller i respons til matrix stivhed.
Abstract
Stive tumorvæv har været stærkt impliceret i regulering af cancer cellemigration og invasion. Invasiv migration gennem tværbundne væv lettes af actin-rige fremspring kaldet invadopodia der proteolytisk nedbryder den ekstracellulære matrix (ECM). Invadopodia aktivitet har vist sig at være afhængig af ECM stivhed og cancercelle kontraktile kræfter tyder på, at stivhed signaler kan regulere disse subcellulære strukturer gennem actomyosin kontraktilitet. Invasive og kontraktile egenskaber kræftceller kan korreleres in vitro ved hjælp invadopodia og trækkraft assays baseret på polyacrylamidgeler (PaaS) af forskellige stivheder. Invasive og kontraktile egenskaber kræftceller kan korreleres in vitro ved hjælp invadopodia og trækkraft assays baseret på polyacrylamidgeler (PaaS) af forskellige stivheder. Mens nogle forskelle mellem de to analyser findes, protokollen præsenteres her er en metode til at skabe PAA'er thpå kan bruges i begge analyser og er let at tilpasse til brugerens specifikke biologiske og tekniske behov.
Introduction
Stivheden af tumor-associerede ECM er blevet identificeret som en væsentlig faktor i at køre malign adfærd ved at øge actomyosin kontraktilitet 1-3. Selv om denne virkning primært er blevet demonstreret med brystcancerceller, er matrix stivhed vist sig at ændre invasive egenskaber af celler afledt fra en række af cancertyper 4-8 tyder på, at tumor stivhed kan spille en rolle i andre typer af cancere. For at trænge tværbundne væv under invasive migration, kræftceller udnytter actin-rige klæbende fremspring kaldet invadopodia der lokaliserer proteinaser til fokalt forringe ECM 9. Invadopodia betragtes kendetegnende for invasive celler og har været impliceret i tumorcelleinvasion og metastase 10,11. Tidligere arbejde har vist, at matrix stivhed kan regulere invadopodia numre og tilhørende ECM nedbrydning 4,12 gennem myosin II-aktivitet og mekanosensitive proteiner 12. I betragtning af denkorrelation mellem tumor tæthed og cancer aggressivitet 13,14, tyder disse resultater på en mekanisme, ved hvilken cancerceller kan reagere på stive tumorvæv at drive invasion og metastase gennem actomyosin kontraktilitet.
In vitro ECM stivhed og in vivo væv densitet er blevet vist at regulere invasive opførsel af cancerceller 1,15-17. Mens actomyosin kontraktilitet synes at være vigtige i denne proces aktuelle undersøgelser konflikt, hvorvidt metastatisk kapacitet er korreleret til øget eller nedsat kontraktile kræfter 6,18-20. Endvidere er det fortsat uvist, om disse kræfter direkte mediere invadopodia aktivitet 21. Vi fandt for nylig, at kræftcellen kontraktile styrker var afhængige af matrix stivhed og var prædiktiv for ECM nedbrydning ved invadopodia 5. Disse resultater tyder på, at cellulære kræfter kan spille en vigtig rolle i udviklingen af kræft ved at mediere invadopodia activitet som reaktion på de mekaniske egenskaber af tumormikromiljøet.
For at korrelere invasive og kontraktile egenskaber kræftceller 5, vi ændret en protokol til at skabe PAA'er med forskellige stivheder, der tidligere blev brugt til at undersøge stivhed-afhængig invadopodia aktivitet 4,12,22. Ved kemisk tværbinding human plasma fibronectin hele PAA'er kan disse modificerede hydrogeler anvendes som grundlag for både invadopodia og trækkraft assays for at sikre, at celler oplevet de samme stivheder i begge forsøg 5. I invadopodia assays fibronectin giver en naturlig bindingsdomæne for gelatine at knytte overlejret ECM til PAA'er at detektere matrixnedbrydning. I trækkraften assays fibronectin tilvejebringer en ligand for direkte cellulær adhæsion til påvisning mikrosfære forskydninger anvendes til at beregne cellulære trækkræfter. Denne metode resulterer i det, vi har kaldt bløde, hårde,og stive PAA'er, der er bundet til glasbund retter og har elastik moduli, E, på 1.023, 7.307 og 22.692 Pa 5, som spænder over forskellige mekaniske egenskaber rapporteret for normale og ondartede væv 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer en fremgangsmåde til fremstilling PAA'er, der kan anvendes som grundlag for invadopodia og trækkraft assays at korrelere invasive og kontraktile cellulære adfærd. Mens PAA'er længe har været brugt til at se på stivhed effekter på celler og beregne trækkræfter 18,24,27, denne protokol er den første til at udvikle parallelle assays baseret på PAA'er med samme stivheder at korrelere invasive og kontraktile cellulære adfærd som reaktion på matrix mekaniske egenskaber. Ko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
| goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
| mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
| sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |
References
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
- Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
- Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
- Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
- Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
- Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
- Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
- Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
- Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
- Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
- Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
- Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A., Coutts, A. S. . Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. 1046, 171-189 (2013).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
- Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
- Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
- Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).
