Polyakrylamidgeler for Invadopodia og trekkraft Analyser på kreftceller
Summary
Mekanisk stivhet i svulsten mikromiljøet spiller en avgjørende rolle i å drive ondartet oppførsel ved å øke invadopodia aktivitet og actomyosin kontraktilitet. Ved hjelp av polyakrylamidgeler (Paas), kan invadopodia og trekkraft analyser anvendes for å studere de invasive og kontraktile egenskaper av kreftceller i respons til matrise stivhet.
Abstract
Stive tumorvev har vært sterkt implisert i regulering av kreftcelle migrering og invasjon. Invasiv migrasjon gjennom tverrbundet vev er tilrettelagt av aktin rike fremspring kalt invadopodia at proteolytisk forringer ekstracellulære matrise (ECM). Invadopodia aktivitet har vist seg å være avhengig av ECM stivhet og kreftcelle kontraktile krefter som tyder på at stivhet signaler kan regulere disse subcellulære strukturer gjennom actomyosin kontraktilitet. Invasive og kontraktile egenskaper av kreftceller kan være korrelert in vitro ved hjelp invadopodia og trekkraft analyser basert på polyakrylamidgeler (PaaS) av ulike stivheter. Invasive og kontraktile egenskaper av kreftceller kan være korrelert in vitro ved hjelp invadopodia og trekkraft analyser basert på polyakrylamidgeler (PaaS) av ulike stivheter. Mens noen variasjoner mellom de to analysene finnes, protokoll er presentert her tilveiebringer en fremgangsmåte for å lage Paas thpå kan brukes i begge analysene og kan enkelt tilpasses til brukerens spesifikke biologiske og tekniske behov.
Introduction
Stivheten av tumorassosierte ECM har blitt identifisert som en betydelig faktor i å drive malign oppførsel ved å øke actomyosin kontraktilitet 1-3. Selv om denne effekten har primært blitt demonstrert med brystkreftceller, har matriksen stivhet blitt funnet å endre invasive egenskaper av celler avledet fra en rekke forskjellige krefttyper 4-8 som tyder på at tumor stivhet kan spille en rolle i andre typer kreft. Å trenge krysskoblede vev under invasiv migrasjon, kreftceller utnytte aktin rike selvklebende utstikkere kjent som invadopodia at lokalisere proteinaser å fokalt degradere ECM 9. Invadopodia anses et kjennetegn på invasive celler og har vært involvert i tumorcelle invasjon og metastase 10,11. Tidligere arbeid har vist at matrise stivhet kan regulere invadopodia tall og tilhørende ECM degradering 4,12 gjennom myosin II aktivitet og mechanosensitive proteiner 12. GittKorrelasjonen mellom tumor tetthet og kreft aggressivitet 13,14, antyder disse resultatene en mekanisme som kreftceller kan svare til stive tumorvev for å drive invasjon og metastase gjennom actomyosin kontraktilitet.
In vitro ECM stivhet og in vivo vev tetthet er blitt vist å regulere invasiv opptreden av kreftceller 1,15-17. Mens actomyosin kontraktilitet synes å være viktig i denne prosessen, nåværende studier konflikt med hensyn til om metastatisk kapasitet er korrelert til økt eller redusert sammentrekkende krefter 6,18-20. Videre er det fortsatt ukjent om disse kreftene direkte megle invadopodia aktivitet 21. Vi har nylig funnet ut at kreftcelle kontraktile styrker var avhengig matrise stivhet og var prediktiv av ECM degradering av invadopodia 5. Disse resultatene tyder på at celle krefter kan spille en viktig rolle i cancerutvikling ved å mediere invadopodia activitet som reaksjon på de mekaniske egenskapene til tumormikromiljøet.
For å korrelere invasive og kontraktile egenskaper kreftceller 5, endret vi en protokoll for å skape PaaS med ulike stivheter som tidligere ble brukt til å undersøke stivhet avhengig invadopodia aktivitet 4,12,22. Ved kjemisk tverrbinding human plasma fibronektin hele Paas, kan disse modifiserte hydrogeler kan brukes som grunnlag for både invadopodia og trekkraft assays for å sikre at celler opplevde de samme stivheter i begge forsøk 5. I invadopodia analyser, gir fibronektinet en naturlig bindende domene for gelatin å knytte kledde ECM til PaaS å oppdage matriksdegradering. I trekkraft analyser, gir fibronektinet en ligand for direkte cellular heft å påvise mikro forskyvninger som brukes til å beregne cellulære trekkrefter. Denne metoden gir det vi har kalt myk, hard,og stive PaaS som er bundet til glassbunn retter og har elastiske moduli, E, av 1023, 7307 og 22692 Pa 5 som består av alt av mekaniske egenskaper som er rapportert for normale og cancervev 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterer en metode for å fabrikkere PaaS som kan brukes som grunnlag for invadopodia og trekkraft analyser for å korrelere invasive og kontraktile cellulære atferd. Mens PaaS har lenge vært brukt til å se på stivhet virkninger på celler og beregne trekkrefter 18,24,27, er den første til å utvikle parallelle analyser basert på PaaS med samme stivheter å korrelere invasive og kontraktile cellulære atferd i respons til matrise denne protokollen mekaniske egenskaper. Riktig aktivering glassene a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
| goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
| mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
| sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |
References
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
- Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
- Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
- Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
- Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
- Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
- Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
- Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
- Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
- Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
- Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
- Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A., Coutts, A. S. . Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. 1046, 171-189 (2013).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
- Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
- Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
- Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).
