Polyakrylamidgeler för Invadopodia och Traction Force Analyser på cancerceller
Summary
Mekanisk styvhet i tumören mikromiljön spelar en avgörande roll i att driva malignt beteende genom att öka invadopodia aktivitet och aktomyosin kontraktilitet. Använda polyakrylamidgeler (PaaS), kan invadopodia och dragkraft analyser utnyttjas för att studera de invasiva och kontraktila egenskaperna hos cancerceller som svar på matris styvhet.
Abstract
Styva tumörvävnad har varit starkt inblandade i regleringen cancercellmigration och invasion. Invasiv migration genom tvärbundna vävnader underlättas av aktin-rika utsprång kallade invadopodia som proteolytiskt nedbryter den extracellulära matrisen (ECM). Invadopodia aktivitet har visat sig vara beroende av ECM styvhet och cancercell kontraktila krafter som tyder på att styvhet signaler kan reglera dessa subcellulära strukturer genom aktomyosin kontraktilitet. Invasiva och kontraktila egenskaperna hos cancerceller kan korreleras in vitro med användning invadopodia och dragkraft analyser baserade på polyakrylamidgeler (PaaS) av olika styvheter. Invasiva och kontraktila egenskaperna hos cancerceller kan korreleras in vitro med användning invadopodia och dragkraft analyser baserade på polyakrylamidgeler (PaaS) av olika styvheter. Medan vissa variationer mellan de två analyserna existerar, det protokoll som presenteras här ger en metod för att skapa PaaS thpå kan användas i båda analyserna och är lätt att anpassa till användarens specifika biologiska och tekniska behov.
Introduction
Styv av tumörassocierade ECM har identifierats som en betydande faktor i att driva malignt beteende genom att öka aktomyosin kontraktilitet 1-3. Även om denna effekt har främst visats med bröstcancerceller, har matris styvhet befunnits förändra invasiva egenskaper hos celler som härrör från en rad olika cancerformer 4-8 tyder på att tumör styvhet kan spela en roll i andra typer av cancer. Att tränga tvärbundna vävnader under invasiva migration, cancerceller använder aktin rika självhäftande utsprång kallas invadopodia som lokalisera proteinaser att fokalt försämra ECM 9. Invadopodia anses kännetecknande för invasiva celler och har implicerats i tumörcellinvasion och metastas 10,11. Tidigare arbete har visat att matris styvhet kan reglera invadopodia nummer och tillhörande ECM nedbrytning 4,12 genom myosin II aktivitet och mechanosensitive proteiner 12. Med tanke på denkorrelation mellan tumörtäthet och cancer aggressivitet 13,14, dessa resultat antyder en mekanism genom vilken cancerceller kan svara på styva tumörvävnad att driva invasion och metastas genom aktomyosin kontraktilitet.
In vitro ECM styvhet och in vivo vävnadsdensitet har visats reglera invasiva beteendet hos cancerceller 1,15-17. Medan aktomyosin kontraktilitet verkar vara viktiga i denna process, nuvarande studier konflikt om huruvida metastaser kapaciteten är korrelerad till ökad eller minskad kontraktila krafter 6,18-20. Dessutom är det fortfarande okänt om dessa krafter som direkt förmedlar invadopodia aktivitet 21. Vi fann nyligen att cancercellen kontraktila styrkor var beroende av matris styvhet och var prediktiva för ECM nedbrytning genom invadopodia 5. Dessa resultat tyder på att cellulära krafter kan spela en viktig roll vid cancerutveckling genom att mediera invadopodia activitet som svar på de mekaniska egenskaperna hos tumörens mikromiljö.
För att korrelera invasiva och kontraktila egenskaperna hos cancerceller 5, modifierade vi ett protokoll för att skapa PaaS med olika styvheter som tidigare användes för att undersöka styvhet beroende invadopodia aktivitet 4,12,22. Genom kemisk tvärbindning humant plasmafibronektin hela PaaS, kan dessa modifierade hydrogeler användas som grund för både invadopodia och dragkraft-analyser för att säkerställa att celler upplevt samma stelheten i båda experimenten 5. I invadopodia analyser tillhandahåller fibronektin en naturlig bindningsdomän för gelatin för att länka den överlagrade ECM till PaaS att detektera matrisnedbrytning. I dragkraften analyserna ger fibronektin en ligand för direkt cellulär adhesion att upptäcka mikrosfär förskjutningar används för att beräkna cellulära dragkrafter. Metoden ger det vi har kallat mjukt, hårt,och stela PaaS som är bundna till glas botten rätter och har elastiska moduler, E, av 1,023, 7307, och 22.692 Pa 5 som spänner över intervallet av mekaniska egenskaper som rapporterats för normala och cancervävnader 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterar en metod för att tillverka PaaS som kan användas som grund för invadopodia och dragkraft analyser för att korrelera invasiva och kontraktila cellulära beteenden. Medan PaaS har länge använts för att titta på styvhet effekter på celler och beräkna dragkrafter 18,24,27, är den första att utveckla parallella analyser baserade på PaaS med samma stelbenthet att korrelera invasiva och kontraktila cellulära beteenden som svar på matrisen detta protokoll mekaniska egenskaper. Korrekt ak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna har ingenting att lämna.
Materials
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
| goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
| mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
| sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |
References
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
- Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
- Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
- Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
- Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
- Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
- Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
- Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
- Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
- Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
- Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
- Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A., Coutts, A. S. . Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. 1046, 171-189 (2013).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
- Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
- Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
- Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).
