Funktionel Opløsning og kanalaktivitet Målinger af renset Vildtype og Mutant CFTR Protein
Summary
Beskrevet her er en hurtig og effektiv procedure for funktionel rekonstitution af oprenset vildtype og mutant CFTR-protein, som bevarer aktivitet for denne chloridkanal, som er defekt i cystisk fibrose. Iodid efflux fra rekonstitueret proteoliposomer medieret af CFTR tillader studier af kanalaktivitet og virkningerne af små molekyler.
Abstract
Cystisk fibrose transmembrane Konduktans regulator (CFTR) er en unik kanaldannende medlem af ATP Binding Cassette (ABC) superfamilien af transportører. Phosphoryleringen og nukleotid afhængig klorid kanal aktivitet af CFTR er ofte blevet undersøgt i hele cellesystemer og som enkelte kanaler i udskårne membran patches. Mange cystisk fibrose-mutationer er blevet vist at ændre denne aktivitet. Mens et lille antal oprensningsprotokoller er blevet offentliggjort, har en hurtig rekonstitution metode, der bevarer kanalaktivitet og en egnet fremgangsmåde til at studere befolkning kanalaktivitet i et oprenset system, har manglet. Her hurtige fremgangsmåder er beskrevet til oprensning og funktionel rekonstitution af CFTR-proteinet i fuld længde i proteoliposomer med defineret lipidsammensætning, der bevarer aktivitet som et reguleret halogenid kanal. Denne opløsning metode sammen med en ny flux-baserede assay af kanal aktivitet er et egnet system tilstudere befolkningen kanal egenskaber vildtype CFTR og sygdomsfremkaldende mutanter F508del- og G551D-CFTR. Specifikt fremgangsmåden har anvendelighed i at studere de direkte virkninger af phosphorylering, nukleotider og små molekyler, såsom forstærkere og inhibitorer på CFTR kanalaktivitet. Metoderne er også modtagelig for studiet af andre membran kanaler / transportapparater til anioniske substrater.
Introduction
Chloride transport over den apikale membraner af epitelceller i sådanne væv, som lunge, tarm, bugspytkirtel og svedkirtler medieres primært af cystisk fibrose transmembrane konduktionsregulatorkanaler (CFTR), en ATP- og phosphorylering reguleret medlem af ABC (ATP- Binding Cassette) C underfamilie af membranproteiner (revideret i 1). Ligesom andre medlemmer af ABCC underfamilien, CFTR er en stor, multi-spænder integreret membranprotein, som binder ATP ved to nukleotid-bindingssteder dannet ved grænsefladen af dets nucleotid-bindende domæner (NBDs), hvor det har beskedne ATPase aktivitet ved en enkelt site. I modsætning til andre ABCC underfamilie- medlemmer, CFTR udviklet som et enestående reguleret Cl kanal snarere end som en aktiv solut transporter.
Mutationer i CFTR årsag cystisk fibrose, en sygdom, der påvirker flere organer, herunder lungerne, mave-tarmkanalen, pancreas og forplantningsorganer, hvilket fører til Morbidity og dødelighed hos unge voksne. Lungesygdomme typisk tegner sig for tidlig mortalitet i cystisk fibrose og i de fleste tilfælde er forårsaget af tab af CFTR-funktion på overfladen epitel af de ledende luftveje. Manglen på CFTR chloridkanal aktivitet forårsager en reduktion i både Cl – og vand bevægelse hen over overfladen epitel at ændre det fluide lag på den apikale overflade af cilierede respiratorisk epitel. Dette resulterer i en viskøs luftvej overflade væske, der svækker evnen af cilierede respiratoriske epitelceller til effektivt klare patogener ud af luftvejene. Som følge heraf er de fleste CF-patienter lider af tilbagevendende anfald af lungeinfektion og lungeskade som følge af inflammation.
Som forventet, undersøgelser af virkningsmekanismen af den normale CFTR-proteinet primært fokuseret på detaljerede elektrofysiologiske studier af dets kanal gating aktivitet. Enkelt kanal har vist direkte at CFTR fungerer som en PKA-afhængig Cl– Kanal, der besidder en ATP reguleret gate 2. Detaljerede elektrofysiologiske undersøgelser giver en hel del oplysninger om enkelte CFTR-kanaler 1,3, men der kan være bekymring for, om de særlige kendetegn ved en bestemt enkelt kanal, der er blevet undersøgt, er reflekterende af hele befolkningen i CFTR-kanaler og derfor enkelt kanal Resultaterne bør altid overvejes sammen med metoder til at studere den makroskopiske befolkning. Direkte assay af befolkningen kanalaktivitet af renset CFTR har potentialet til at give indsigt i den molekylære defekt forbundet med sygdomsfremkaldende mutationer og at køre opdagelse af kemiske modulatorer som reparation mutant CFTR proteiner. Til dato er der overstiger 1.900 forskellige mutationer i CFTR menes at forårsage cystisk fibrose 4. Den største mutation, F508del-CFTR, findes på mindst en allel i ca. 90% af patienterne i Nordamerika og Europa fører til protein misfoldning enND tilbageholdelse i det endoplasmatiske reticulum 5. F508del-CFTR har også andre konsekvenser, herunder defekte kanal aktivitet 6-9. Den resulterende fravær af CFTR fra celleoverfladen er forbundet med svær sygdom. G551D-CFTR, en mindre almindelig mutation, menes at være foldet korrekt endnu er dysfunktionel som et chlorid kanal på celleoverfladen 6. Udviklingen af små molekyler korrektorer og potentiatorer har som mål at korrigere foldning og / eller handel med mutanter som F508del-CFTR til celleoverfladen, og forstærkende eller øge kanalaktivitet af mutationer som G551D når til stede på celleoverfladen, henholdsvis . Mens korrektorer VX-809 og VX-661 (endnu ikke er godkendt til brug hos patienter, den potentiator Kalydeco (ivacaftor, VX-770) bliver brugt på 150 mg hver 12. time i CF-patienter> 6 år med mindst et G551D -CFTR mutation, og for nylig for patienter med en af G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pog G1349D. Kalydeco er både sikker og resulterer i forbedring af de kliniske foranstaltninger CF sygdom 10 men virkningsmekanismen af denne lille molekyle dårligt forstået på tidspunktet for FDA godkendelse til brug i patienter.
En håndfuld CFTR rensningsmetoder er blevet beskrevet tidligere 2,11-18, hvoraf mange kræver længere tid at gennemføre. I en nylig publikation 19, var en enestående hurtig oprensning og rekonstitution beskrevne metode for CFTR overudtrykt i S f 9 celleekspressionssystem, og det oprensede protein i definerede lipidsystemer blev anvendt til at udvikle en CFTR halogenid kanalaktivitet assay for en population af CFTR molekyler. Assayet rekapitulerer de kendte virkninger af phosphorylering, nukleotider og inhibitorer på CFTR-funktion. Systemet blev anvendt til at forespørge virkningerne af potentiator VX-770 / Kalydeco på Wt- (vildtype), F508del- og G551D-CFTR og det blev vist for den førstetid at lægemidlet interagerer direkte med CFTR-proteinet at forstærke dens kanalaktivitet i en ATP-uafhængig måde, hvilket viser anvendeligheden og anvendeligheden af disse metoder til studiet af interaktionen af CFTR og mutanter med nukleotider og små molekyler fra en population perspektiv besvare klinisk relevante spørgsmål om proteinet. Metoderne er også blevet anvendt til at undersøge andre potentiator molekyler og deres derivater 20, samt virkningerne af et lille molekyle corrector på aktiviteten af proteinet 21.
Efflux assays er blevet anvendt i mange undersøgelser, der tidligere for at undersøge aktiviteten af CFTR mutanter og virkningerne af CFTR-modulerende forbindelser på dets aktivitet, herunder hel celleassays ved hjælp af elektroder, radioaktive sporstoffer og fluoroforer 22,23, membranvesikler med ionselektive elektroder 24 og oprenset rekonstitueret CFTR med radioaktive sporstoffer 25. Men the brug af ionselektive elektroder at studere renset rekonstitueret CFTR blev først rapporteret for nylig 19. En tilpasning af den nuværende metode er blevet anvendt til rekonstitution og funktionel karakterisering af to membranproteiner i Pseudomonas aeruginosa, en fælles CF patogen. Rekonstituering af oprenset alge ydre membranprotein kombineret med iodid efflux målinger blev anvendt til at understøtte en model for anionisk alginat sekretion gennem denne transportør 26. Opløsning og iodid efflux målinger blev anvendt på det oprensede Wzx protein, som tillod en model, der skal foreslås, antyder en H + -afhængig antiport mekanisme til lipid-bundet oligosaccharid translokation på tværs af bakterielle indre membran af dette protein 27. I begge tilfælde iodid blev anvendt som et surrogat for den anioniske substrat, omend ved lavere kapacitet, end man kunne forvente for et nativt substrat. Fremgangsmåden kan være egnet til tilpasning til andre proteiner med Cationic transport- eller ledningsforstyrrelser veje for anioniske substrater.
Her er en hurtig oprensning procedure er beskrevet for CFTR-proteinet og dets rekonstituering i proteoliposomer med defineret lipid. Den hurtige rekonstituering procedure kan let skræddersyes til brug med CFTR renset ved andre metoder, forudsat at den type vaskemiddel, der anvendes i oprensningen er modtagelig for fjernelse af de metoder, der anvendes her, eller kan veksles til et passende rengøringsmiddel før rekonstituering procedure. Den iodid efflux metode til måling af kanal aktivitet af oprenset og rekonstitueret CFTR-proteinet er beskrevet i detaljer, og nogle typiske resultater, der kan opnås fra denne fremgangsmåde præsenteres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der har været et begrænset antal oprensningsprotokoller for fuld længde, funktionel CFTR isolation fra en række cellulære overekspression systemer. Den her beskrevne metode er fordelagtig, da det giver mulighed for hurtig oprensning af Wt-CFTR eller høj berigelse af F508del- og G551D-CFTR i moderate mængder, er yderst funktionel i analyser, herunder ATPase og direkte målinger af kanal-funktion, herunder enkelt kanal målinger i plane dobbeltlag systemer og demonstreret foranstaltninger af CFTR befolkning kanal f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
References
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
