Functionele Het oplossen en Channel activiteit Metingen van gezuiverde wildtype en mutante CFTR eiwit
Summary
Hier beschreven is een snelle en efficiënte procedure voor de functionele reconstitutie van gezuiverde wildtype en mutante CFTR-eiwit dat activiteit behoudt deze chloride kanaal, die defect in Cystic Fibrosis. Jodide efflux uit opgelost proteoliposomen gemedieerd door CFTR maakt studies van het kanaal en de effecten van kleine moleculen.
Abstract
De Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is een uniek-kanaal vormen lid van het ATP-binding cassette (ABC) superfamilie van transporteurs. De fosforylering en nucleotide afhankelijk chloride kanaal activiteit van CFTR is veelvuldig onderzocht in volledige cel systemen en als enkele kanalen in weggesneden membraan patches. Veel Cystic fibrosis veroorzaken mutaties bleken deze activiteit veranderen. Terwijl een klein aantal zuiveringsprotocollen gepubliceerd, zijn een snelle reconstructie methode kanaal activiteit behoudt en een geschikte methode voor het bestuderen populatie kanaal activiteit in een gezuiverd systeem ontbroken. Hier snelle werkwijzen beschreven voor zuivering en functionele reconstitutie van de volledige lengte CFTR-eiwit in proteoliposomen gedefinieerde lipiden die activiteit behoudt als gereglementeerde halogenide kanaal. Deze reconstructie methode om samen met een nieuw-flux gebaseerde test van de activiteit op het kanaal is een geschikt systeem voorhet bestuderen van de bevolking kanaal eigenschappen van wild-type CFTR en de ziekte veroorzaken mutanten F508del- en G551D-CFTR. Specifiek, de methode bruikbaarheid bij het bestuderen van de directe effecten van fosforylatie, nucleotiden en kleine moleculen zoals versterkers en inhibitoren op CFTR kanaalactiviteit. De werkwijzen zijn ook ontvankelijk voor de studie van andere membraankanalen / transporters voor anionische substraten.
Introduction
Chloride transport over de apicale membranen van epitheelcellen in dergelijke weefsels zoals de longen, darmen, alvleesklier en zweetklieren wordt voornamelijk gemedieerd door de Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), een ATP-en-fosforylering gereguleerd lid van de ABC (ATP- Binding Cassette) C subfamilie van membraaneiwitten (besproken in 1). Net als andere leden van de subfamilie ABCC, CFTR is een grote multi-spanning integraal membraaneiwit dat ATP bindt op twee nucleotide bindingsplaatsen gevormd op het grensvlak van de nucleotide-bindende domeinen (NBD), waar het bezit geringe ATPase activiteit op één het terrein. Anders dan andere ABCC subfamily leden CFTR heeft zich ontwikkeld als een uniek gereguleerde Cl kanaal niet als een actieve opgeloste stof transporter.
Mutaties in CFTR oorzaak Cystic Fibrosis, een ziekte die meerdere organen zoals de longen, maagdarmkanaal, pancreas en voortplantingsorganen, waardoor Morbidity en mortaliteit bij jonge volwassenen. Longziekten goed typisch voor vroege mortaliteit in Cystic Fibrosis en in de meeste gevallen wordt veroorzaakt door het verlies van CFTR-functie op het oppervlak epitheel van de geleidende luchtwegen. Het ontbreken van CFTR chloride kanaal activiteit veroorzaakt een reductie van zowel Cl – en waterbeweging over het oppervlak epitheel de vloeistoflaag op het apicale oppervlak van de trilhaar respiratoire epitheel wijzigen. Dit resulteert in een oppervlak viskeuze vloeistof luchtweg die het vermogen van trilharen respiratoire epitheelcellen vermindert effectief duidelijk ziektekiemen uit de luchtwegen. Bijgevolg meeste CF-patiënten lijden aan herhaalde aanvallen van longontsteking en longschade als gevolg van ontsteking.
Zoals verwacht, studies van het werkingsmechanisme van de normale CFTR-eiwit primair gericht op gedetailleerde elektrofysiologische studies zijn kanaal gating activiteit. Enkel kanaal studies hebben aangetoond direct dat CFTR functioneert als een PKA-afhankelijke Cl– Kanaal dat een ATP-gereglementeerde poort 2 bezit. Gedetailleerde elektrofysiologische studies veel informatie over één CFTR kanalen 1,3, maar er kan zorg of de kenmerken van een bepaald afzonderlijk kanaal dat is onderzocht weerspiegelt de gehele bevolking van CFTR kanalen en derhalve de enkelkanaals resultaten moet altijd worden beschouwd, samen met methoden om de macroscopische bevolking te bestuderen. Directe test van de bevolking kanaal activiteit van gezuiverd CFTR heeft de potentie om inzicht te geven in de moleculaire defect in verband met ziekte-veroorzakende mutaties en ontdekking van chemische modulators die reparatie gemuteerde CFTR-eiwitten rijden. Tot op heden zijn er meer dan 1900 verschillende mutaties in CFTR gedacht te veroorzaken Cystic Fibrosis 4. De belangrijkste mutatie, F508del-CFTR, bij ten minste één allel in ongeveer 90% van de patiënten in Noord-Amerika en Europa leidt tot een eiwit misfoldingnd retentie in het endoplasmatisch reticulum 5. F508del-CFTR heeft ook andere gevolgen, waaronder defecte kanaal activiteit 6-9. De resulterende afwezigheid van CFTR van het celoppervlak geassocieerd met ernstige ziekte. G551D-CFTR, een minder voorkomende mutatie wordt gedacht goed nog gevouwen disfunctioneel als chloride kanaal op het celoppervlak 6. Het ontwikkelen van moleculen correctors en versterkers heeft als doel het corrigeren vouwen en / of handel van mutanten zoals F508del CFTR naar het celoppervlak, en versterkende of verhogen van de kanaalactiviteit van mutaties zoals G551D wanneer aanwezig op het celoppervlak respectievelijk . Terwijl de correctors VX-809 en VX-661 (nog niet goedgekeurd voor gebruik bij patiënten, de potentiator Kalydeco (ivacaftor, VX-770) wordt gebruikt bij 150 mg elke 12 uur bij CF-patiënten> 6 jaar met ten minste één G551D -CFTR mutatie, en meer recent voor patiënten met een van G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pen G1349D. Kalydeco zowel veilig en resulteert in verbetering van de klinische metingen van CF ziekte 10, maar het werkingsmechanisme van deze kleine moleculen is slecht begrepen bij de FDA goedgekeurd voor gebruik bij patiënten.
Een handvol CFTR zuiveringsmethoden zijn eerder beschreven 2,11-18, waarvan vele vereisen een aanzienlijke tijd in beslag. In een recente publicatie 19, werd een unieke snelle zuivering en reconstitutie werkwijze beschreven voor CFTR overexpressie in de Sf 9 cellen expressiesysteem en het gezuiverde eiwit in bepaalde lipide systemen gebruikt om CFTR halogenide kanaalactiviteit assay te ontwikkelen voor een populatie van CFTR moleculen. De assay recapituleert de bekende effecten van fosforylering, nucleotiden en inhibitoren op CFTR-functie. Het systeem werd gebruikt om de effecten van de potentiator ondervragen VX-770 / Kalydeco op gew- (wild-type), F508del- en G551D-CFTR en werd voor het eersttijd dat het geneesmiddel direct een interactie met het CFTR-eiwit te zijn kanaal activiteit in een ATP-onafhankelijke wijze versterken, demonstreren het nut en de toepasbaarheid van deze werkwijzen voor het bestuderen van de interactie van CFTR en mutanten met nucleotiden en kleine moleculen uit een populatie perspectief beantwoorden klinisch relevante vragen over het eiwit. De werkwijzen zijn ook gebruikt om andere versterkingsmiddel moleculen en derivaten daarvan 20, alsook de effecten van een klein molecuul corrector op de activiteit van het eiwit 21 te bestuderen.
Efflux assay zijn gebruikt in vele studies die eerder voor de activiteit van CFTR mutanten en de effecten van CFTR-modulerende verbindingen op de activiteit, met inbegrip van hele cel assays met elektroden radioactieve tracers en fluoroforen 22,23, membraan blaasjes met ion selectieve elektroden 24 onderzoeken en gezuiverd gereconstitueerde CFTR met radioactieve tracers 25. Echter the gebruik van ion-selectieve elektroden aan gezuiverde gereconstitueerde CFTR studie werd voor het eerst onlangs 19 gemeld. Een aanpassing van de huidige methode is gebruikt voor de bereiding en functionele karakterisatie van twee membraaneiwitten in Pseudomonas aeruginosa, een gemeenschappelijk CF pathogeen. Reconstitutie van gezuiverde alge buitenmembraan eiwit gekoppeld jodide efflux metingen werden gebruikt om een model van anionische alginaat secretie ondersteunen door deze transporteur 26. Reconstitutie en jodide efflux metingen werden toegepast op gezuiverde Wzx eiwit, waardoor een model voorgesteld dat een H + -afhankelijke antiport mechanisme lipiden gekoppelde oligosaccharide translocatie over het bacteriële binnenmembraan suggereert van dit eiwit 27. In beide gevallen werd jodide gebruikt als een surrogaat voor de anionische substraat, zij het in lagere doorvoersnelheid dan men zou verwachten voor een native substraat. De werkwijze kan geschikt zijn voor aanpassing aan andere eiwitten met zijn cationic vervoer of geleidingsroutes voor anionische substraten.
Hier een snelle zuiveringsprocedure beschreven voor het CFTR-eiwit en reconstitutie in proteoliposomen gedefinieerde lipide. De snelle reconstitutie procedure kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met CFTR gezuiverd door andere methoden, mits het soort wasmiddel bij de zuivering vatbaar is voor verwijdering door de hier gebruikte methoden of kan worden vervangen door een geschikt reinigingsmiddel voor de reconstitutie procedure. Het jodide efflux Werkwijze voor het meten van kanaalactiviteit van gezuiverd en gereconstitueerd CFTR-eiwit wordt beschreven en enkele typische resultaten die kunnen worden verkregen uit deze werkwijze worden gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn een beperkt aantal zuiveringsprotocollen volledige lengte, functioneel CFTR afgezonderd, uit verschillende cellulaire overexpressie systemen. De hier beschreven methode is voordelig omdat hiermee snelle zuivering van WT-CFTR of hoog verrijkt F508del- en G551D-CFTR in matige hoeveelheden die zeer functioneel in assays zoals ATPase en directe metingen van kanaalfunctie, waaronder enkel kanaal metingen vlakke dubbellaag systemen en bewezen maatregelen van CFTR bevolking kanaal functie die zeer relevant zijn voor de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
References
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
