Функциональная Реорганизация и активности канала измерения очищенной дикого типа и мутантных CFTR белка
Summary
Описанный здесь быстрое и эффективная процедура для функционального восстановления очищенного дикого типа и мутантного белка CFTR, который сохраняет активность в течение этого хлорида канала, который с дефектами муковисцидозом. Йодид отток из восстановленных протеолипосомах посредничестве CFTR позволяет исследования активности канала и эффекты малых молекул.
Abstract
Муковисцидоз трансмембранной проводимости регулятора (CFTR) является уникальный канал формирования член СПС связывающего кассетного (ABC) суперсемейство перевозчиков. Фосфорилирования и нуклеотидов хлорид зависит канал активности CFTR неоднократно изучается в целом клеточных системах и в качестве отдельных каналов в отделенных мембранных участков. Многие муковисцидоза, вызывающих мутации, как было показано, чтобы изменить эту деятельность. Хотя были опубликованы небольшое количество протоколов очистки, быстрый метод восстановление, который сохраняет активность канала и подходящий метод исследования активности канала населения в очищенной системе не хватало. Здесь быстрые способы описаны для очистки и функциональной восстановления в CFTR белка полной длины в протеолипосом определенного состава липидов, который сохраняет активность в регулируемом галогенида канала. Этот метод восстановление вместе с новым потока на основе анализа активности канала является подходящим для системыизучения свойств каналов населения дикого типа гена CFTR и болезнетворные мутантов F508del- и G551D-CFTR. В частности, способ имеет применение в изучении прямое воздействие фосфорилирования, нуклеотидов и малых молекул, таких как усилителей и ингибиторов на активность канала CFTR. Эти методы также поддаются изучению других мембранных каналов / транспортеры для анионных субстратов.
Introduction
Хлорид транспорта через апикальные мембраны эпителиальных клеток в таких тканях, как легких, кишечника, поджелудочной железы и потовых желез, в первую очередь при посредничестве муковисцидоза трансмембранной проводимости регулятора (CFTR), в АТФ и фосфорилирования регулируется члена ABC (АТФ связывающего кассетного) C подсемейство мембранных белков (обзор в 1). Как и другие члены подсемейства ЦКА, CFTR является большой, мульти-охватывающей интегральный мембранный белок, который связывается АТФ при двух нуклеотидных участков связывания образующихся на границе своих нуклеотидных-связывающих доменов (NBDs), где он имеет более скромные АТФазы в единый сайт. Однако, в отличие от других членов ЦКА подсемейства, CFTR превратилась в уникальный регулируемого канала Cl, а не в качестве активного растворенного транспортера.
Мутации в CFTR вызывают муковисцидоз, заболевание, поражающее многие органы, включая легкие, желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы и половых путей, ведущих к МорбиДЕТИ и смертности в молодых взрослых. Заболевание легких, как правило, составляет ранней смертности в кистозного фиброза и в большинстве случаев вызвано потерей функции CFTR на поверхности эпителия проводящих дыхательных путей. Отсутствие канала хлорида активности CFTR вызывает снижение как Cl – и движение воды по поверхности эпителия, чтобы изменить слой жидкости на апикальной поверхности мерцательного эпителия дыхательных путей. Это приводит к поверхности жидких, вязких дыхательных путей, что ухудшает способность ресничками дыхательных эпителиальных клеток эффективно очистить патогены из дыхательных путей. Как следствие, большинство пациентов с МВ страдают от периодических приступов инфекции легких и повреждения легких из-за воспаления.
Как и ожидалось, исследования механизма действия нормального белка CFTR сосредоточены главным образом на детальных электрофизиологических исследований его канал литниковой деятельности. Холост исследования каналов показали прямо сказать, что CFTR функции, как ПВА-зависимой Cl– Канал, который обладает регулируемой ворота АТФ 2. Подробные электрофизиологические исследования дают много информации о единичных CFTR каналов 1,3, однако могут быть беспокойство, поскольку от того, характеристики какого-либо конкретного одного канала, которая была изучена отражает всего населения CFTR каналов и, следовательно, одноканальный Результаты всегда следует рассматривать вместе с методами изучения макроскопических населения. Прямой анализ канала активности населения очищенного CFTR имеет потенциал, чтобы обеспечить понимание молекулярной дефекта, связанного с болезнетворными мутациями и управлять открытие химических модуляторов которые ремонт мутант CFTR белков. На сегодняшний день, существует свыше 1900 различных мутаций в CFTR считают причиной кистозного фиброза 4. Основным мутация, F508del-CFTR, найденный, по крайней мере одного аллеля примерно у 90% пациентов в Северной Америке и Европе приводит к белок неправильного сворачиванияУдержание й в эндоплазматический ретикулум 5. F508del-CFTR также имеет и другие последствия, в том числе деятельности 6-9 неисправен канала. Полученный отсутствие CFTR с поверхности клеток связано с тяжелого заболевания. G551D-CFTR, менее распространенной мутацией, как полагают, пока должным образом сложены дисфункциональна качестве канала хлорида в клеточной поверхности 6. Разработка малых молекул корректоров и усилителей имеет целью коррекции складывание и / или оборота мутантов, таких как F508del-CFTR на клеточной поверхности, и потенцирования или увеличение активности канала мутаций, таких как G551D, когда он присутствует на поверхности клеток, соответственно , В то время как корректоры VX-809 и VX-661 (еще не утверждены для использования в пациентов, в потенцирующее Kalydeco (ivacaftor; VX-770) используется в 150 мг каждые 12 ч у пациентов с МВ> 6 лет, по крайней мере, один G551D -CFTR мутация, а в последнее время для пациентов с одним из G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pи G1349D. Kalydeco является безопасным и приводит к улучшению клинических показателей заболевания CF 10, однако механизм действия этой маленькой молекулы плохо понимал в момент утверждения FDA для применения у пациентов.
Горстка CFTR методов очистки были описаны ранее 2,11-18, многие из которых требуется значительное время, чтобы закончить. В недавней публикации 19, уникальный быстрое очищение и восстановление метод был описан CFTR сверхэкспрессируется в S F системы 9-ячеечной экспрессии, и это очищенный белок в определенных липидных системах была использована для разработки CFTR галогенида активности канала анализа для населения CFTR Молекулы. Анализ повторяет известные эффекты фосфорилирования, нуклеотидов и ингибиторов на функцию CFTR. Система была использована, чтобы допросить эффекты потенцирующее VX-770 / Kalydeco на вес (дикого типа), F508del- и G551D-CFTR и было показано, для первогоВремя, препарат взаимодействует непосредственно с белком CFTR, чтобы усиливать свой канал активности в АТР-независимым образом, демонстрируя полезность и применимость этих методов к изучению взаимодействия CFTR и мутантов с нуклеотидов и малых молекул с точки зрения населения к ответить клинически значимых вопросы белка. Методы были также использованы для изучения других молекул потенцирующее и их производные 20, а также эффекты корректора небольшой молекулы на активность белка 21.
Отток анализы были использованы во многих исследованиях ранее для расследования деятельности CFTR мутантов и эффекты CFTR-модуляторных соединений о своей деятельности, в том числе целых клеточных анализов с использованием электродов, радиоактивные индикаторы и флуорофоры 22,23, мембранных везикул с ионоселективных электродов 24 и очищали восстановленного CFTR с помощью радиоактивной метки 25. Однако йе использование ионоселективных электродов для изучения очищенный восстановленный CFTR был первым сообщил недавно 19. Адаптация текущего метода был использован для восстановления и функциональной характеристике двух мембранных белков в синегнойной палочки, общий CF возбудителя. Восстановление очищенного Alge белком наружной мембраны в сочетании с измерениями йодида оттока были использованы для поддержки модель анионного секреции альгината через этот транспортер 26. Восстановление и измерения йодида оттока были применены к очищенной Wzx белка, что позволило модели, которые будут предложены, что предполагает H + -зависимую механизм антипорта для липидов-связаны олигосахаридов транслокации через бактериальную внутреннюю мембрану этим белком 27. В обоих случаях йодид был использован в качестве заменителя для анионного субстрата, хотя и при более низкой пропускной способности, чем можно было бы ожидать для нативным субстратом. Способ может быть пригодным для адаптации к другим белкам с Cationic транспортные или проводимости пути для анионных субстратов.
Здесь быстрая процедура очистки описан белок CFTR и его восстановления в протеолипосом с определенным липидов. Быстрое восстановление процедура может быть легко адаптированы для использования с CFTR очищенной другими способами, при условии, что тип моющего средства использовали дл очистки поддается удалению с помощью методов, используемых здесь, или может быть обменен на подходящего моющего средства перед процедурой восстановления. Йодида методом отток для измерения канала активности очищенной и восстановленного белка CFTR подробно описано и некоторые типичные результаты, которые могут быть получены из этого метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Там было ограниченное количество протоколов очистки на всю длину, изоляции функциональной CFTR, из множества сотовых систем избыточной экспрессии. Способ, описанный здесь, является предпочтительным, так как позволяет быстрое очищение WT-CFTR или высокой обогащения F508del- и G551D-CFTR в умеренных…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
References
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
