Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein
Summary
Beschrieben wird hier ein schnelles und wirksames Verfahren für die funktionelle Rekonstitution von gereinigten Wildtyp- und mutierten CFTR-Proteins, die die Aktivität für dieses Chloridkanal, der bei zystischer Fibrose fehlerhaft ist bewahrt. Iodid-Efflux aus rekonstituierter Proteo von CFTR vermittelten ermöglicht Untersuchungen der Kanalaktivität und die Auswirkungen von kleinen Molekülen.
Abstract
Die Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) ist eine eindeutige Kanal-Bildungselement von der ATP-Bindungskassette (ABC) -Superfamilie von Transportern. Die Phosphorylierung und Nucleotid-abhängigen Chlorid-Kanal-Aktivität von CFTR wurde häufig in Ganzzellsystemen und als einzelne Kanäle in abgetrennten Membranflecken untersucht. Viele Mukoviszidose verursachenden Mutationen wurde gezeigt, dass diese Aktivität ändern. Obwohl eine kleine Anzahl von Reinigungsprotokolle sind veröffentlicht worden, haben eine schnelle Rekonstitution Methode Kanalaktivität beibehält und ein geeignetes Verfahren zur Untersuchung Population Kanalaktivität in einem gereinigten System fehlte. Hier schnelle Methoden zur Reinigung und funktionelle Rekonstitution des Volllängen-CFTR-Protein in Proteoliposomen von definierten Lipid-Zusammensetzung, die eine Aktivität als geregelter Halogenid Kanal beibehält beschrieben. Diese Rekonstiutionsmethode zusammen mit einem neuen Fluß basierenden Assay Kanalaktivität ist ein geeignetes System zurStudium der Bevölkerung Kanaleigenschaften von Wildtyp-CFTR und die krankheitserregenden Mutanten F508del- und G551D-CFTR. Insbesondere weist das Verfahren die Anwendung in der Untersuchung der direkten Effekte der Phosphorylierung, Nukleotide und kleine Moleküle wie Potentiatoren und Inhibitoren auf die CFTR-Kanalaktivität. Die Verfahren sind sich auch zur Untersuchung anderer Membrankanäle / Transporter für anionische Substrate.
Introduction
Chlorid-Transports durch die apikale Membran von Epithelzellen in Geweben wie der Lunge, des Darms, der Bauchspeicheldrüse und Schweißdrüsen wird primär von der Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), einem ATP- und Phosphorylierung reguliert Mitglied der ABC (ATP-vermittelten Binding Cassette) C-Unterfamilie von Membranproteinen (in 1 überprüft). Wie andere Mitglieder der ABCC Familie ist CFTR eine große, mehr Spanning integrales Membranprotein, das an zwei ATP-Nukleotid-Bindungsstellen an der Schnittstelle ihrer Nukleotid-(NBDs), wo es geringe ATPase-Aktivität besitzt, in einer einzigen gebildet bindet Website. Im Gegensatz zu anderen ABCC Familie Mitglieder CFTR wurde als einzigartiges geregelten Cl Kanal anstatt als aktiven gelösten Transporter entwickelt.
Mutationen im CFTR Ursache Mukoviszidose, einer Krankheit, die mehrere Organe wie die Lunge, Magen, Darm, Pankreas-und Fortpflanzungsorgane, was zu morbidity und Mortalität bei jungen Erwachsenen. Lungenerkrankungen nimmt normalerweise Frühletalität bei zystischer Fibrose und in den meisten Fällen wird durch den Verlust der CFTR-Funktion auf dem Oberflächenepithel der leitenden Atemwegen verursacht wird. Der Mangel an CFTR Chlorid-Kanal-Aktivität führt zu einer Verringerung sowohl der Cl – und Wasserbewegung über die Oberfläche Epithel, um die Fluidschicht auf der apikalen Oberfläche der Wimper Respirationsepithels modifizieren. Dies führt zu einem viskosen Atemwegsoberflächenflüssigkeit, die die Fähigkeit von Wimper respiratorischen Epithelzellen beeinträchtigt effektiv klare Pathogenen aus den Atemwegen. Als Folge sind die meisten CF-Patienten leiden unter wiederkehrenden Anfällen von Lungenentzündung und Lungenschäden aufgrund einer Entzündung.
Wie erwartet, Studien über den Wirkungsmechanismus des normalen CFTR-Protein konzentrierte sich hauptsächlich auf detaillierten elektrophysiologische Untersuchungen der Kanalöffnung Aktivität. Einkanal-Studien haben direkt, dass CFTR fungiert als PKA-abhängige Cl gezeigt– Kanal, der ein ATP-regulierten Tor 2 besitzt. Detaillierte elektrophysiologische Studien bieten eine Vielzahl von Informationen über einzelne CFTR-Kanäle 1,3, es kann jedoch Sorge, ob die Eigenschaften eines bestimmten einzelnen Kanal, der untersucht wurde, ist repräsentativ für die gesamte Bevölkerung von CFTR-Kanäle und damit die einzelnen Kanal Testergebnisse sollten stets zusammen mit Methoden, um die makroskopischen Bevölkerung studieren berücksichtigt werden. Direkter Assay der Bevölkerung Kanalaktivität von gereinigtem CFTR hat das Potential, um einen Einblick in die molekularen Defekts mit krankheitsverursachenden Mutation assoziiert ist und Entdeckung chemischer Modulatoren, die Reparatur mutierten CFTR-Proteine zu treiben. Bis heute gibt es mehr als 1.900 verschiedene Mutationen im CFTR gedacht, um Mukoviszidose 4 verursachen. Der Haupt Mutation F508del-CFTR, auf mindestens einem Allel in etwa 90% der Patienten in Nordamerika und Europa führt zu Proteinfehlfaltung and Retention im endoplasmatischen Retikulum 5. F508del-CFTR hat auch andere Folgen, einschließlich defekte Kanalaktivität 6-9. Die sich ergebende Fehlen von CFTR von der Zelloberfläche ist mit einer schweren Erkrankung. G551D-CFTR, eine weniger häufige Mutation, wird angenommen, dass noch richtig gefaltet dysfunktional als Chlorid-Kanal an der Zelloberfläche 6 ist. Die Entwicklung niedermolekularer Korrektoren und Potentiatoren hat das Ziel, Korrektur Faltung und / oder Menschen von Mutanten, wie F508del-CFTR an der Zelloberfläche und potenzierende oder Erhöhung der Kanalaktivität von Mutationen wie G551D, wenn sie auf der Zelloberfläche vorhanden sind, jeweils . Während die Korrektoren VX-809 und VX-661 (noch nicht zur Anwendung bei Patienten zugelassen, die Potentiator Kalydeco (Ivacaftor, VX-770) wird auf 150 mg alle 12 h bei CF-Patienten> 6 Jahre mit mindestens einem G551D verwendet -CFTR Mutation, und in jüngerer Zeit für Patienten mit einem G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pund G1349D. Kalydeco sowohl sicher und führt zu einer Verbesserung der klinischen Maßnahmen CF Krankheit 10 ist jedoch der Mechanismus der Wirkung des kleinen Moleküls war schlecht bei der FDA-Zulassung für die Anwendung bei Patienten verstanden.
Eine Handvoll von CFTR Reinigungsverfahren wurden zuvor 2,11-18, von denen viele erfordern eine beträchtliche Zeitdauer in Anspruch beschrieben. In einer kürzlich erschienenen Publikation 19 wurde eine einzigartige schnelle Reinigung und Rekonstitution Verfahren zur CFTR in Sf 9-Zellen-Expressionssystem überexprimiert beschrieben, und das gereinigte Protein in definierten Lipidsystem wurde verwendet, um ein CFTR Halogenid Kanalaktivitätstest für eine Population von CFTR entwickeln Molekülen. Der Assay fasst die bekannten Wirkungen der Phosphorylierung, Nukleotide und Inhibitoren auf die CFTR-Funktion. Das System wurde verwendet, um die Wirkungen der Potentiator abzufragen VX-770 / Kalydeco auf Wt (Wildtyp), F508del- und G551D-CFTR und es wurde zum ersten Mal gezeigtZeit, die das Arzneimittel interagiert direkt mit dem CFTR-Protein, seine Kanalaktivität in einem ATP-unabhängigen Weise zu verstärken, was die Nützlichkeit und Anwendbarkeit dieser Verfahren auf die Untersuchung der Wechselwirkung von CFTR und Mutanten mit Nukleotiden und kleinen Molekülen aus einer Population Perspektive beantworten klinisch relevante Fragen zum Protein. Die Verfahren sind auch verwendet worden, um andere Potentiator Moleküle und deren Derivate 20, als auch die Auswirkungen eines kleinen Moleküls Korrektor auf die Aktivität des Proteins 21 zu studieren.
Efflux-Assays wurden in vielen Studien verwendet worden, die zuvor um die Aktivität des CFTR-Mutanten und die Wirkungen von CFTR-modulatorische Verbindungen auf ihre Aktivität, einschließlich der Gesamtzelltests unter Verwendung von Elektroden, radioaktiven Tracer und Fluorophore 22,23, Membranvesikel mit ionenselektiven Elektroden 24 zu untersuchen und gereinigt wieder hergestellt CFTR mit radioaktiver Tracer 25. Allerdings the Verwendung von ionenselektiven Elektroden zu reinig wiederhergestellt CFTR Studie wurde vor kurzem 19 ausgewiesen. Eine Anpassung der aktuellen Methode ist für die Rekonstitution und funktionelle Charakterisierung der beiden Membranproteine von Pseudomonas aeruginosa, einem gemeinsamen CF Pathogen verwendet. Rekonstitution von gereinigten Alge Protein der äußeren Membran gekuppelt mit Jodid Efflux-Messungen wurden verwendet, um ein Modell für die anionische Alginat Sekretion durch diese Transporter 26 zu unterstützen. Rekonstitution und Iodid Auslauf Messungen wurden mit dem gereinigten WZX Protein, das ein Modell vorgeschlagen werden, die ein H + -abhängigen Antiport-Mechanismus für die Lipid-verknüpftes Oligosaccharid Translokation über die bakteriellen Innenmembran schlägt dieses Protein 27 dürfen angewandt. In beiden Fällen wurde Jodid als Surrogat für die anionische Substrat bei geringeren Durchsatz verwendet, wenn auch, als man für eine native Substrat erwarten. Das Verfahren kann für die Anpassung an andere Proteine, die mit c istationic Transport oder Leitungsbahnen für die anionische Substrate.
Hier wird eine schnelle Reinigungsverfahren ist für den CFTR-Proteins und seiner Rekonstitution in Proteoliposomen von definierten Lipid beschrieben. Die rasche Rekonstitution kann leicht zur Verwendung mit CFTR durch andere Verfahren gereinigt zugeschnitten werden, dass die Art des Detergens in der Reinigung verwendet zugänglich ist, um die Entfernung von den hier verwendeten Methoden oder nach einem geeigneten Detergens vor der Rekonstitution ausgetauscht werden. Das Iodid Efflux Verfahren zur Messung der Kanalaktivität der gereinigten und rekonstituierten CFTR-Protein ist im Detail beschrieben, und einige typische Ergebnisse, die durch dieses Verfahren erhalten werden können, sind dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gab eine beschränkte Anzahl von Reinigungsprotokolle für Volllängen-funktionelle CFTR Isolierung war, aus einer Vielzahl von Zellexpression Systemen. Das hier beschriebene Verfahren ist vorteilhaft, da sie ermöglicht eine schnelle Reinigung von Wt-CFTR oder hohe Anreicherung von F508del- und G551D-CFTR in moderaten Mengen, die hochfunktionell in Assays einschließlich ATPase und direkte Messungen der Kanalfunktion, einschließlich Einzelkanalmessungen in planaren Doppelschicht Systeme und zeigte Maßnahmen CFTR P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
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