מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant
Summary
שתואר כאן הוא הליך מהיר ויעיל לכינון מחדש פונקציונלי של מטוהר wild-type וחלבון CFTR מוטציה המשמרת את פעילות לערוץ כלוריד הזה, שהוא פגום בסיסטיק פיברוזיס. זרימת יודיד מproteoliposomes מחדש בתיווכו של CFTR מאפשרת לימודים של פעילות ערוץ ואת ההשפעות של מולקולות קטנות.
Abstract
סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות הרגולטור (CFTR) הוא חבר יוצרי ערוץ ייחודי של ATP כריכת קלטת superfamily (ABC) של מובילים. פעילות ערוץ זירחון וכלוריד התלוי נוקלאוטיד של CFTR נחקרה לעתים קרובות במערכות תא כולו וכערוצים בודדים בתיקוני קרום נכרתו. מוטציות הגורם לסיסטיק פיברוזיס רבים הוכחו לשנות פעילות זו. בעוד מספר קטן של פרוטוקולי טיהור פורסמו, שיטה מהירה לשיקום שומרת פעילות ערוץ ושיטה מתאימה ללימוד פעילות ערוץ אוכלוסייה במערכת מטוהרת היו חסרה. שיטות כאן מהירות מתוארות לטיהור וכינון מחדש תפקודי של חלבון CFTR באורך המלא לproteoliposomes של הרכב שומנים בדם מוגדר ששומר על פעילות כערוץ הליד מוסדר. שיטה זו הכינון מחדש יחד עם assay מבוסס שטף רומן של פעילות ערוץ היא מערכת מתאימה ללומד את מאפייני אוכלוסייה של ערוץ CFTR סוג בר ומוטציות הגורמות למחל F508del- וG551D-CFTR. באופן ספציפי, יש לו את השיטה שירות בלימוד ההשפעות הישירות של זירחון, נוקלאוטידים ומולקולות קטנות כגון potentiators ומעכבים על פעילות ערוץ CFTR. השיטות גם נתונים למחקר של ערוצים / מובילי קרום אחרים למצעי anionic.
Introduction
תחבורת כלוריד פני ממברנות הפסגה של תאי האפיתל ברקמות כגון בלוטות ריאות, מעי, הלבלב וזיעה מתווכת בעיקר על ידי סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות הרגולטור (CFTR), ATP- וחבר-מוסדר זירחון של ABC (ATP- כריכת subfamily הקלטת) C של חלבונים בממברנה (הנסקרת ב 1). כמו חברים אחרים של תת-משפחת Abcc, CFTR הוא חלבון גדול, רב-פורש נפרד קרום שקושר ATP בשני אתרי קישור נוקלאוטיד נוצרו בממשק של תחומים מחייב נוקלאוטיד (NBDs), בם יש לי פעילות ATPase צנועה באחת אתר. עם זאת, בניגוד לחברים תת-משפחת Abcc אחרים, CFTR התפתח כערוץ Cl מוסדר ייחודי ולא כטרנספורטר המומס פעיל.
מוטציות בגורם CFTR סיסטיק פיברוזיס, מחלה הפוגעת באיברים רבים, כולל ריאות, מערכת עיכול, לבלב ואיברי רבייה, שמובילות לmorbidity ותמותה במבוגרים צעירים. מחלת ריאות בדרך כלל חשבונות לתמותה מוקדמת בסיסטיק פיברוזיס וברוב המקרים נגרמת על ידי אובדן תפקוד CFTR על האפיתל של דרכי הנשימה ביצוע המשטח. חוסר בפעילות ערוץ כלוריד CFTR גורם להפחתה בשני Cl – ותנועת מים על פני האפיתל פני השטח כדי לשנות את שכבת הנוזל על משטח הפסגה של אפיתל הנשימה ריסי. התוצאה היא נוזל צמיג שטח בדרכי נשימה שפוגע ביכולת של תאי אפיתל נשימה ריסי ליעילות פתוגנים מדרך הנשימה ברורים. כתוצאה מכך, רוב חולי CF סובלים מהתקפים חוזרים ונשנים של דלקת ריאות ונזק ריאות בשל דלקת.
כצפוי, מחקרים של מנגנון פעולה של חלבון CFTR הנורמלי התמקדו בעיקר במחקרי אלקטרו מפורטים של פעילות gating הערוץ שלה. מחקרי ערוץ אחד הראו כי פונקציות ישירות CFTR כPKA-תלוי Cl– ערוץ שבו בעל שער מוסדר ATP 2. מחקרי אלקטרו מפורטים לספק מידע רב על ערוצי CFTR יחידים 1,3, אולם ייתכנו דאגה באשר לשאלה האם המאפיינים של כל ערוץ אחד מסוים שנחקר הוא שיקוף של כל אוכלוסיית ערוצי CFTR ולכן ערוץ אחד תוצאות תמיד צריכים לשקול יחד עם שיטות ללמוד האוכלוסייה מקרוסקופית. assay הישיר של פעילות ערוץ האוכלוסייה של CFTR מטוהר יש הפוטנציאל לספק תובנה הפגם המולקולרי הקשורים למוטציות הגורמות למחלות ולנהוג גילוי מאפננים כימיים שתיקון חלבוני CFTR המוטציה. נכון להיום, יש עודף של 1,900 מוטציות שונות בCFTR חשבו לגרום סיסטיק פיברוזיס 4. המוטציה הגדולה, F508del-CFTR, הנמצאת באלל אחד לפחות בכ -90% מהחולים בצפון אמריקה ובאירופה מובילה לחלבון misfoldingשמירת nd בreticulum endoplasmic 5. F508del-CFTR יש גם השלכות אחרות, הכולל את פעילות ערוץ פגום 6-9. היעדרות כתוצאה של CFTR מתא השטח מזוהה עם מחלה קשה. G551D-CFTR, מוטציה נפוצה פחות, הוא חשב להיות מקופל עדיין כראוי הוא לא מתפקד כערוץ כלוריד על פני תא 6. הפיתוח של מתקן מולקולה קטן וpotentiators יש את המטרה של תיקון מתקפל ו / או סחר של מוטציות כגון F508del-CFTR לשטח פני התא, וpotentiating או הגדלת פעילות הערוץ של מוטציות כגון G551D כאשר קיים על פני התא, בהתאמה . בעוד מתקן VX-809 וVX-661 (עדיין לא אושר לשימוש בחולים, potentiator Kalydeco (ivacaftor; VX-770) נמצא בשימוש ב 150 מ"ג כל 12 שעות בחולי CF> 6 שנים עם לפחות אחד G551D מוטציה -CFTR, ולאחרונה בחולים עם אחד מG178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255PוG1349D. Kalydeco הוא גם בטוח וגם תוצאות בשיפור אמצעים קליניים של המחלה CF 10, אולם מנגנון פעולה של מולקולה קטנה זה הבין היטב בעת אישור ה- FDA לשימוש בחולים.
קומץ של שיטות טיהור CFTR תוארו בעבר 2,11-18, שרבים מהם דורשים אורך ניכר של זמן כדי להשלים. בפרסום האחרון 19, שיטת טיהור והכינון מחדש מהירה ייחודית תוארה לCFTR ביטוי יתר במערכת הביטוי 9 תא f S, וחלבון מטוהר זה במערכות שומנים מוגדרות שימש לפיתוח assay פעילות ערוץ הליד CFTR לאוכלוסייה של CFTR מולקולות. Assay משחזר את ההשפעות הידועות של זירחון, נוקלאוטידים ומעכבים על תפקוד CFTR. המערכת הייתה בשימוש כדי לחקור את ההשפעות של potentiator VX-770 / Kalydeco על Wt- (wild-type), F508del- וG551D-CFTR וזה הוצגו בראשוןזמן שתרופת אינטראקציה ישירות עם חלבון CFTR להגברת פעילות הערוץ שלה באופן ATP-עצמאי, הממחישה את התועלת ותחולתה של שיטות אלה לחקר האינטראקציה של CFTR ומוטציות עם נוקלאוטידים ומולקולות קטנות מנקודת מבט אוכלוסייה ל לענות על שאלות רלוונטיות מבחינה קלינית על החלבון. השיטות יש גם שימשו ללמוד מולקולות אחרות potentiator ונגזרותיהם 20, כמו גם את ההשפעות של מתקן מולקולה קטן בפעילות של החלבון 21.
מבחני בזרימת היו בשימוש במחקרים רבים בעבר כדי לחקור את הפעילות של מוטציות CFTR ואת ההשפעות של תרכובות CFTR-modulatory על פעילותה, ובכלל זה מבחני תא כולו באמצעות אלקטרודות, קליעים נותבים רדיואקטיבי וfluorophores 22,23, שלפוחית עם קרום אלקטרודות סלקטיבית יון 24 , וטהר CFTR מחדש עם קליעים נותבים רדיואקטיבי 25. עם זאת thשימוש בדואר של אלקטרודות סלקטיבית היון ללמוד מטוהר CFTR מחדש דווח לראשונה לאחרונה 19. הסתגלות של השיטה הנוכחית הייתה בשימוש כבר הכינון מחדש ואפיון פונקציונלי של שני חלבוני קרום בPseudomonas aeruginosa, הפתוגן CF נפוץ. הכינון מחדש חלבון מטוהר alge חיצוני קרום יחד עם מדידות זרימת יודיד שלהם המשמשים לתמיכת מודל להפרשת אלגינט anionic דרך טרנספורטר זה 26. כינונה מחדש ומדידות זרימת יודיד יושמו חלבון Wzx המטוהר, שאיפשר מודל להצעה שמציעה H + מנגנון antiport + תלוי לטרנסלוקציה oligosaccharide צמוד שומנים על פני הקרום הפנימי החיידקים על ידי חלבון זה 27. בשני המקרים יודיד שימש כתחליף למצע anionic, אם כי בתפוקה נמוכה יותר מכפי שאפשר לצפות למצע ילידים. השיטה עשויה להיות מתאימה להסתגלות לחלבונים אחרים עם גמסלולי תחבורה או הולכה ationic מצעי anionic.
כאן תהליך טיהור מהיר מתואר לחלבון CFTR והרכבתה מחדש לproteoliposomes של שומנים בדם מוגדרים. הליך הכינון מחדש המהיר יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם CFTR מטוהר על ידי שיטות אחרות, ובלבד שהסוג של חומר ניקוי בטיהור ניתן להסרה בשיטות המשמשות כאן או ניתן להחליף אבקת כביסה מתאימה לפני הליך הכינון מחדש. שיטת זרימת יודיד למדידת פעילות ערוץ חלבון CFTR המטוהר והמשוחזר של מתוארת בפירוט וכמה תוצאות טיפוסיות שניתן להשיג משיטה זו מוצגות.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש כבר מספר מוגבל של פרוטוקולי טיהור לאורך מלא, בידוד CFTR פונקציונלי, ממגוון רחב של מערכות ביטוי יתר סלולריות. השיטה המתוארת כאן היא יתרון שכן היא מאפשרת טיהור מהירה של WT-CFTR או גבוהה העשרת F508del- וG551D-CFTR בכמויות מתונות שהיא מאוד פונקציונלי במבחנים כוללים ATPase ומדידות ישיר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
References
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
