Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri
Summary
Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.
Abstract
Kistik fibroz membran geçirgenliğinin düzenleyicisi (CFTR), taşıyıcıların Kaset (ABC) süper ailesinin ATP bağlayıcı bir benzersiz bir kanal oluşturan bir üyesidir. CFTR fosforilasyon ve nükleotid bağlı klorür kanal etkinliği sık bütün hücre sistemleri ve kesilen membran yamalar tek kanal olarak incelenmiştir. Birçok Kistik Fibroz-neden olan mutasyonlar bu aktiviteyi değiştirmek için gösterilmiştir. Arıtma protokolleri az sayıda yayınlanmış olsa da, kanal aktivitesini muhafaza eden bir hızlı yeniden oluşturma yöntemi ve saflaştırılmış bir sistem içinde nüfus kanalı etkinliğini incelemek için uygun bir yöntem, eksik edilmiştir. Burada hızlı yöntemler düzenlenmiş bir halid kanalı olarak etkinliğini muhafaza eden, lipid tanımlanan bileşimin proteoliposomes haline getirilerek, ve tam uzunluktaki CFTR proteininin işlevsel olarak yeniden tarif edilmiştir. Birlikte kanal aktivitesi olan yeni bir akı bazlı deneyde Bu yeniden oluşturma yöntemi için uygun bir sistemdirvahşi tip CFTR nüfus kanal özelliklerini ve hastalık yapıcı mutantlar F508del- ve G551D-CFTR okuyan. Özel olarak, yöntem, fosforilasyon, nükleotidler ve bu tür CFTR kanal aktivitesi üzerindeki kuvvetlendirici ve inhibitörleri olarak küçük moleküllerin doğrudan etkilerinin araştırılması yararlıdır. yöntem aynı zamanda, anyonik maddeler için başka membran kanal / taşıyıcıların çalışma için uygun.
Introduction
Akciğer, bağırsak, pankreas ve ter bezleri gibi dokularda epitel hücrelerinin apikal membranlar arasında Klorür taşıma öncelikle ABC Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR), bir ATP ve fosforilasyon-regüle üyesi (ATP aracılık 1 gözden membran proteinlerinin Kaset) C alt ailesini () Bağlayıcı. ABCC alt ailesinin diğer üyeleri gibi CFTR nükleotid-bağlayıcı etki tek mütevazı ATPaz aktivitesine sahip (NBDs), ara yüzünde oluşan iki nükleotid bağlama sahalarında ATP bağlanan bir geniş, çok geçişli bir integral membran proteinidir sitesi. Ancak, diğer ABCC alt familyası üyeleri aksine, CFTR eşsiz düzenlenmiş Cl kanalı olarak yerine aktif bir çözünen taşıyıcı olarak gelişmiştir.
Morbi giden CFTR neden Kistik Fibrozis, akciğerler, gastrointestinal sistem, pankreas ve üreme yolu da dahil olmak üzere birçok organı etkileyen bir hastalık mutasyonlar,Genç erişkinlerde dity ve ölüm. Akciğer hastalığı, genellikle iletken solunum yollarının yüzey epiteli üzerine CFTR fonksiyon kaybı neden olur Kistik Fibrozis erken mortalite ve çoğu durumda hesapları. siliyalı solunum epiteli apikal yüzeyinde sıvı tabakası değiştirmek için yüzey epiteli boyunca ve su hareketi – CFTR klorür kanal aktivitesinin eksikliği hem Cl azalmaya neden olur. Bu kirpikli solunum epitel hücrelerinin yeteneğini bozar viskoz havayolu yüzey sıvı sonuçlanır hava yollarının dışında etkin bir açık patojenler için. Sonuç olarak, çoğu CF hasta akciğer enfeksiyonu ve iltihabı nedeniyle akciğer hasarı atakları muzdarip.
Beklendiği gibi, normal bir CFTR proteininin etki mekanizmasının çalışmaları öncelikle kanal yolluk aktivitesinin detaylı elektrofizyolojik çalışmalar üzerinde duruldu. Tek kanallı çalışmalar bir pKa bağımlı Cl gibi doğrudan bu CFTR fonksiyonlarını göstermişlerdir– ATP düzenlenmiş kapısı 2 sahiptir kanalı. Çalışılmıştır herhangi bir tek bir kanal özellikleri dolayısıyla tüm CFTR kanallarının nüfus ve tek kanal yansıtıcı olup olmadığı detaylı elektrofizyolojik çalışmalar tek CFTR kanalları 1,3 bilgilerin büyük bir sağlamak, ancak endişe olabilir Sonuçlar her zaman makroskobik nüfusu çalışma yöntemleri ile birlikte düşünülmelidir. Saflaştınldı CFTR nüfus kanal aktivitesinin doğrudan tahlil hastalığa neden olan mutasyonlar ile bağlantılı moleküler bozukluğun ilişkin bilgi sağlar ve kimyasal modülatörleri tamir mutan CFTR proteini keşfini potansiyeline sahiptir. Bugüne kadar, Kistik Fibrozis 4 neden olduğu düşünülmektedir CFTR 1.900 farklı mutasyonlar aşan vardır. Kuzey Amerika ve Avrupa'da hastaların yaklaşık% 90'ında en az bir alleli bulunan büyük mutasyon, F508del-CFTR, protein hatalı katlanması yol açarendoplazmik retikulum 5 nci tutma. F508del-CFTR da arızalı kanal faaliyeti 6-9 dahil olmak üzere diğer sonuçları vardır. hücre yüzeyinden CFTR elde edilen olmaması şiddetli hastalık ile ilişkilidir. G551D-CFTR, daha az yaygın mutasyon, düzgün henüz katlanmış hücre yüzeyinde 6 bir klorür kanalı olarak işlevsiz olduğunu düşünülmektedir. küçük molekül düzelticisi ve güçlendiricileri gelişimi sırasıyla hücre yüzeyi üzerinde mevcut olan bir katlama ve / veya hücre yüzeyine F508del-CFTR gibi mutantların kaçakçılığı ve güçlendirici düzeltilmesi veya bu gibi G551D mutasyonların kanal aktivitesini arttırma amacı vardır . 150 mg KF hastalarında> 6 yıl en az bir G551D ile her 12 saatte de kullanılan, VX-770); düzelticiler, VX-809 ve VX-661 (henüz hastalarda kullanımı, güçlendiricisi Kalydeco (ivacaftor onaylanmayan da -CFTR mutasyon ve daha yakın zamanda hastalar için G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255P biriyleve G1349D. Kalydeco CF hastalığının 10 klinik önlemler, bu küçük molekülün eylem Ancak mekanizması zayıf hastalarda kullanılmak üzere FDA onayı sırasında anlaşılmıştır iyileştirilmesi güvenli ve sonuçları hem de.
CFTR saflaştırma yöntemleri bir avuç önce tamamlamak için önemli bir zaman uzunluğu gerekli çoğu 2,11-18 tarif edilmiştir. Son zamanlarda yayınlanan 19, özel bir hızlı saflaştırma ve yeniden çözme yöntemi Sf 9 hücre ifade sistemi içinde aşırı ifade CFTR için tarif edilmiştir ve tanımlanan lipid sistemleri bu saflaştırılmış protein CFTR oluşan bir popülasyon için bir CFTR halojenür kanal etkinliği test geliştirmek için kullanılmıştır moleküller. Tahlil CFTR fonksiyonu fosforilasyon, nükleotidler ve inhibitörlerinin bilinen etkilerini özetler. Sistem bir potansiyatör etkilerini sorgulamak için kullanılmıştır VX-770 / Kalydeco ağırlıkça (vahşi tip), F508del- ve G551D-CFTR ve ilk için gördüilaç için bir nüfus açısından CFTR ve nükleotidler ve küçük moleküller ile mutantların etkileşimi çalışmasında bu yöntemlerin kullanımını, uygulanabilir gösteren, bir ATP-bağımsız bir şekilde, kanal aktivitesini güçlendirmek için, CFTR proteini ile doğrudan etkileşime giren bir zaman protein hakkında klinik olarak ilgili sorulara cevap. yöntemler, başka potansiyatör molekülleri ve bunların türevleri 20, hem de protein 21 aktivitesine küçük bir molekül düzeltici etkilerini incelemek için kullanılmıştır.
Efflux deneyleri daha önce elektrotlar, radyoaktif izleyiciler ve florofor 22,23 kullanılarak bütün hücre tahlilleri, iyon seçici elektrotlar 24 ile zar vezikülleri dahil olmak üzere CFTR mutantlarının aktivitesini ve etkinliği üzerindeki CFTR modülatör bileşiklerinin etkilerini araştırmak üzere pek çok çalışmada kullanılmıştır ve radyoaktif izleyiciler 25 ile yeniden CFTR saflaştırılmış. Ancak thsaflaştırılmış yeniden CFTR çalışma iyon seçici elektrotlar e kullanımı ilk geçenlerde 19 bildirilmiştir. Mevcut yöntemin bir adaptasyonu yeniden ve Pseudomonas aeruginosa, ortak bir KF patogen içinde iki membran proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılmıştır. Iyodür akış ölçümleri ile birlikte saf hale alge dış zar proteininin yeniden oluşturulması, bu taşıyıcı 26 boyunca anyonik alginat salgılama için bir model desteklemek için kullanılmıştır. Sulandırma ve iyodür akış ölçümleri, bir model bu protein 27 ile bakteri iç zarı boyunca lipit bağlantılı oligosakarit translokasyon için bir H + -bağlı antiport mekanizması ileri sürdüler izin saflaştırılmış Wzx protein uygulanmıştır. Bir yerel bir alt-tabaka için beklenebilir daha Her iki durumda da iyodür daha düşük kapasite ile de olsa, anyonik alt-tabaka için bir vekil olarak kullanılmaktadır. yöntem c başka proteinler adaptasyon için uygunanyonik yüzeyler için ationic taşıma veya iletim yolları.
Burada bir hızlı saflaştırma prosedürü CFTR proteini ve tanımlanan lipid proteoliposomes içine yeniden tarif edilmiştir. hızlı yeniden oluşturma işlemi kolayca arıtılmadan kullanılan deterjan türü burada kullanılan yöntemler ile ayrıştığı ya da rekonstitüsyon işlem öncesinde uygun bir deterjan için değiştirilebilmesi şartıyla, diğer yöntemlerle arıtılır CFTR ile kullanım için uygun hale getirilebilir. Saflaştırılmış ve yeniden CFTR proteininin kanal aktivitesinin ölçülmesi için iyodür akış yöntemi ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve bu yöntem kullanılarak elde edilen bazı tipik sonuçlar sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücresel aşırı ekspresyonu sistemleri çeşitli, tam uzunluktaki fonksiyonel CFTR izolasyonu için saflaştırma protokolleri sınırlı sayıda olmuştur. Bu ATP ve düzlemsel iki tabakalı, tek kanallı ölçümleri de dahil olmak üzere kanal fonksiyonunun doğrudan ölçümleri, aşağıdakileri içeren deneylerde son derece işlevseldir, Wt-CFTR veya orta miktarlarda F508del- ve G551D-CFTR yüksek zenginlikte hızlı saflaştırılmasına olanak tanımaktadır burada tarif edilen yöntem avantajlıdır, Küçü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
References
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
