Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR
Summary
Décrit ici est un procédé rapide et efficace pour la reconstitution fonctionnelle de type sauvage purifiée et une protéine de CFTR mutante qui conserve l'activité de ce canal de chlorure, qui est défectueux dans la fibrose kystique. Efflux d'iodure de protéoliposomes reconstituées médiées par CFTR permet des études de l'activité du canal et les effets de petites molécules.
Abstract
La fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR) est un élément de formation de canal unique de l'ATP Binding Cassette (ABC) superfamille des transporteurs. L'activité du canal chlorure nucléotidique et la phosphorylation dépendant de la CFTR a été étudié fréquemment dans des systèmes de cellules entières et que les canaux individuels dans patches membranaires excisées. De nombreuses mutations de fibrose kystique qui causent ont été montré de modification de cette activité. Bien qu'un petit nombre de protocoles de purification ont été publiées, un procédé de reconstitution rapide qui conserve l'activité de canal et un procédé approprié pour l'étude de l'activité du canal de la population dans un système purifié ont fait défaut. Ici méthodes rapides sont décrites pour la purification et la reconstitution fonctionnelle de la protéine CFTR pleine longueur dans des protéoliposomes de composition lipidique défini qui conserve une activité de canal à l'halogénure réglementé. Cette méthode de reconstitution avec un nouvel essai à base de flux de l'activité de canal est un système adapté pourétudier les propriétés du canal de la population de CFTR sauvage et les mutants pathogènes F508del- et G551D-CFTR. Plus précisément, le procédé est utile pour l'étude des effets directs de la phosphorylation, les nucleotides et les petites molécules telles que potentialisateurs et des inhibiteurs sur l'activité du canal CFTR. Les méthodes sont également prêtent à l'étude d'autres canaux / transporteurs membranaires pour les substrats anioniques.
Introduction
transport de chlorure à travers les membranes apicales des cellules épithéliales dans les tissus tels que poumons, intestins, le pancréas et les glandes sudoripares est principalement médiée par la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR), un ATP et membre de phosphorylation réglementés de l'ABC (ATP Binding Cassette) C sous-famille de protéines membranaires (revue dans 1). Comme d'autres membres de la sous-famille SCBA, CFTR est un grand multi-enjambant protéine membranaire intégrale qui se lie l'ATP à deux sites de liaison de nucleotides formée à l'interface de ses domaines de nucleotides de liaison (NBD), où il possède une activité d'ATPase modeste à une seule place. Cependant, contrairement à d'autres membres de la sous-famille ABCC, CFTR a évolué comme un canal Cl réglementé unique, plutôt que comme un soluté transporteur actif.
Des mutations dans la cause de la fibrose kystique CFTR, une maladie affectant plusieurs organes, y compris les poumons, tractus gastro-intestinal, du pancréas et des voies de reproduction, conduisant à morbidité et de la mortalité chez les jeunes adultes. Maladie pulmonaire représente généralement au début de la mortalité et de la fibrose kystique dans la plupart des cas est provoqué par la perte de fonction de la protéine CFTR à la surface de l'épithélium des voies aériennes conductrices. L'absence de l'activité des canaux chlorure CFTR entraîne une réduction à la fois de Cl – et de circulation de l'eau à travers l'épithélium de surface pour modifier la couche de fluide sur la surface apicale de l'épithélium cilié respiratoire. Il en résulte un liquide de surface des voies respiratoires visqueux qui altère la capacité des cellules epitheliales ciliées des voies respiratoires à des agents pathogènes efficacement claires sur les voies respiratoires. En conséquence, la plupart des patients atteints de mucoviscidose souffrent d'épisodes récurrents d'infection pulmonaire et une atteinte des poumons due à l'inflammation.
Comme prévu, les études du mécanisme d'action de la protéine CFTR normale concentrent principalement sur les études électrophysiologiques détaillées de son activité voie de fenêtrage. Des études simples de canal ont montré directement que les fonctions de CFTR comme PKA-dépendante Cl– Canal qui possède une porte ATP réglementé 2. Études électrophysiologiques détaillés fournissent beaucoup d'informations sur les canaux CFTR simples 1,3, mais il peut y avoir des préoccupations quant à savoir si les caractéristiques d'un seul canal particulier qui a été étudié est le reflet de l'ensemble de la population de canaux CFTR et donc le seul canal résultats doivent toujours être considérés ainsi que des méthodes pour étudier la population macroscopique. Dosage direct de l'activité de canal de population de CFTR purifié a le potentiel de donner un aperçu du défaut moléculaire associée à des mutations pathogènes et à conduire la découverte de modulateurs chimiques qui la réparation des protéines CFTR mutant. À ce jour, il ya plus de 1900 mutations différentes dans CFTR pensé pour provoquer la fibrose kystique 4. La mutation majeure, F508del-CFTR, trouvé sur au moins un allèle dans environ 90% des patients en Amérique du Nord et en Europe conduit à un mauvais repliement des protéinesnd rétention dans le réticulum endoplasmique 5. F508del-CFTR a aussi d'autres conséquences, y compris l'activité du canal défectueux 6-9. L'absence résultante de la protéine CFTR à la surface de cellule est associée à une maladie grave. G551D-CFTR, la mutation moins fréquente, est considérée comme étant encore correctement pliée est dysfonctionnel comme un canal chlorure à la surface de la cellule 6. Le développement de petits correcteurs de molécules et potentialisateurs a pour but de corriger de pliage et / ou le trafic de mutants tels que F508del-CFTR à la surface cellulaire, et potentialisant ou en augmentant l'activité de canal de mutations telles que G551D lorsqu'ils sont présents sur la surface des cellules, respectivement . Alors que les correcteurs VX-809 et VX-661 (ne sont pas encore approuvés pour une utilisation chez les patients, le potentialisateur Kalydeco (ivacaftor; VX-770) est utilisé à 150 mg toutes les 12 h chez les patients FC> 6 ans avec au moins un G551D -CFTR mutation, et plus récemment pour les patients avec l'un des G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pet G1349D. Kalydeco est à la fois sûr et des résultats dans l'amélioration des mesures cliniques de la maladie CF 10, mais le mécanisme d'action de cette petite molécule a été mal compris au moment de l'approbation de la FDA pour une utilisation chez les patients.
Une poignée de méthodes de purification CFTR ont été décrits précédemment 2,11-18, dont beaucoup exigent une longueur considérable de temps pour terminer. Dans une publication récente 19, un procédé de purification et reconstitution rapide unique a été décrit pour la protéine CFTR surexprimé dans le S f système d'expression neuf cellulaire, et cette protéine purifiée dans les systèmes lipidiques définies a été utilisé pour développer un essai de l'activité des canaux à l'halogénure d'CFTR pour une population de CFTR molécules. Le dosage récapitule les effets connus de phosphorylation, des nucléotides et des inhibiteurs sur la fonction de la protéine CFTR. Le système a été utilisé pour interroger les effets de la potentialisateur VX-770 / Kalydeco sur poids (-type sauvage), F508del- et G551D-CFTR et il a été montré pour la premièretemps que le médicament interagit directement avec la protéine CFTR à potentialiser son activité de canal de façon ATP-indépendant, ce qui démontre l'utilité et l'application de ces méthodes pour l'étude de l'interaction de la protéine CFTR et mutants avec des nucleotides et des petites molécules à partir d'un point de vue de la population de répondre à des questions cliniquement pertinentes sur la protéine. Les procédés ont également été utilisés pour étudier d'autres molécules de potentialisateur et de leurs dérivés 20, ainsi que les effets d'un correcteur de petite molécule de l'activité de la protéine 21.
des dosages d'efflux ont été utilisées dans de nombreuses études précédemment pour étudier l'activité de mutants CFTR et les effets des composés CFTR-modulateurs sur son activité, y compris des dosages de cellules entières en utilisant des électrodes, des traceurs radioactifs et des fluorophores 22,23, des vésicules membranaires avec électrodes sélectives d'ions 24 , et purifié CFTR reconstitué avec des traceurs radioactifs 25. Cependant thl'utilisation de l'e des électrodes sélectives d'ions pour étudier CFTR reconstitué purifié a été rapporté récemment 19. Une adaptation de la méthode actuelle a été utilisé pour la reconstitution et la caractérisation fonctionnelle de deux protéines membranaires de Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène CF commun. Reconstitution de Alge purifié la protéine de la membrane externe couplé avec des mesures d'efflux iodure ont été utilisés pour soutenir un modèle pour les tensioactifs anioniques alginate la sécrétion par ce transporteur 26. La reconstitution et les mesures de efflux d'iodure ont été appliqués à la protéine purifiée wzx, ce qui a permis un modèle à proposer qui suggère un mécanisme de H + antiport dépendante de la translocation de lipide d'oligosaccharide liée à travers la membrane bactérienne interne de 27 cette protéine. Dans les deux cas iodure a été utilisé comme un substitut pour le substrat anionique, mais à débit plus faible que l'on pourrait attendre d'un substrat natif. Le procédé peut être adapté pour l'adaptation à d'autres protéines ayant des cconduction des voies de transport ou pour des substrats anioniques ationic.
Voici une procédure de purification rapide est décrit pour la protéine CFTR et sa reconstitution dans des protéoliposomes de lipide défini. La procédure de reconstitution rapide peut facilement être adapté pour une utilisation avec CFTR purifié par d'autres procédés, à condition que le type de détergent utilisé dans la purification se prête à l'élimination par des méthodes utilisées ici ou peut être remplacé par un détergent approprié avant la procédure de reconstitution. Procédé d'efflux d'iodure pour la mesure de l'activité du canal CFTR de protéine purifiée et reconstituée est décrit en détail et certains résultats typiques qui peuvent être obtenus par cette méthode sont présentés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il n'y a eu qu'un nombre limité de protocoles de purification de pleine longueur, l'isolement de la protéine CFTR fonctionnelle, à partir d'une variété de systèmes de surexpression cellulaire. Le procédé décrit ici est avantageuse car elle permet une purification rapide de WT-CFTR ou haute enrichissement de F508del- et G551D-CFTR dans des quantités modérées qui est très fonctionnel dans des dosages compris ATPase et des mesures directes de la fonction du canal, y compris les mesures de canal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
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