शुद्ध wildtype और उत्परिवर्ती CFTR प्रोटीन के कार्यात्मक पुनर्गठन और चैनल गतिविधि माप
Summary
यहाँ वर्णित सिस्टिक फाइब्रोसिस में दोषपूर्ण है जो इस क्लोराइड चैनल के लिए गतिविधि को बरकरार रखता है कि शुद्ध जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती CFTR प्रोटीन के कार्यात्मक पुनर्गठन के लिए एक तेजी से और प्रभावी प्रक्रिया है। CFTR द्वारा मध्यस्थता का पुनर्गठन proteoliposomes से आयोडाइड तपका चैनल गतिविधि का अध्ययन और छोटे अणुओं के प्रभाव की अनुमति देता है।
Abstract
सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) ट्रांसपोर्टरों की कैसेट (एबीसी) superfamily बंधन एटीपी की एक अद्वितीय चैनल बनाने सदस्य है। CFTR के फास्फारिलीकरण और न्यूक्लियोटाइड निर्भर क्लोराइड चैनल गतिविधि अक्सर पूरे सेल प्रणाली में और excised झिल्ली पैच में एक चैनल के रूप में अध्ययन किया गया है। कई सिस्टिक फाइब्रोसिस के कारण म्यूटेशन इस गतिविधि को बदलने के लिए दिखाया गया है। शुद्धि प्रोटोकॉल की एक छोटी संख्या में प्रकाशित किया गया है, वहीं चैनल गतिविधि को बरकरार रखे हुए है कि एक तेजी से पुनर्गठन विधि और एक शुद्ध प्रणाली में जनसंख्या चैनल गतिविधि के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त विधि की कमी की गई है। यहां तेजी से तरीकों का एक विनियमित halide चैनल के रूप में गतिविधि को बरकरार रखे हुए है कि परिभाषित लिपिड रचना की proteoliposomes में शुद्धि और पूर्ण लंबाई CFTR प्रोटीन के कार्यात्मक पुनर्गठन के लिए वर्णित हैं। एक साथ चैनल गतिविधि का एक उपन्यास प्रवाह आधारित परख के साथ इस पुनर्गठन विधि के लिए एक उपयुक्त प्रणाली हैजंगली प्रकार CFTR की आबादी चैनल गुण और रोग के कारण म्यूटेंट F508del- और G551D-CFTR का अध्ययन। विशेष रूप से, विधि फास्फारिलीकरण, न्यूक्लियोटाइड और ऐसे CFTR चैनल गतिविधि पर potentiators और inhibitors के रूप में छोटे अणुओं का प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने में उपयोगिता है। तरीकों में भी ऋणात्मक substrates के लिए अन्य झिल्ली चैनल / ट्रांसपोर्टरों का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी हैं।
Introduction
फेफड़े, आंत, अग्न्याशय और पसीने की ग्रंथियों के रूप में इस तरह के ऊतकों में उपकला कोशिकाओं के शिखर झिल्ली भर में क्लोराइड परिवहन मुख्य रूप से एबीसी की सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR), एक ATP- और फास्फारिलीकरण विनियमित सदस्य (ATP- द्वारा मध्यस्थता है 1 में समीक्षा की झिल्ली प्रोटीन की कैसेट) सी उपप्रजाति () बाइंडिंग। ABCC उपपरिवार के अन्य सदस्यों की तरह, CFTR अपने न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी डोमेन के यह एक एकल में मामूली ATPase गतिविधि के पास जहां (NBDs), के इंटरफेस पर गठित दो न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइटों पर एटीपी बांधता है कि एक बड़े, बहु फैले अभिन्न झिल्ली प्रोटीन है साइट। हालांकि, अन्य ABCC उपपरिवार सदस्यों के विपरीत, CFTR एक अद्वितीय विनियमित सीएल चैनल के रूप में नहीं बल्कि एक सक्रिय घुला हुआ पदार्थ ट्रांसपोर्टर के रूप में विकसित किया गया है।
मोरबी के लिए अग्रणी CFTR कारण सिस्टिक फाइब्रोसिस, फेफड़ों, जठरांत्र संबंधी मार्ग, अग्नाशय और प्रजनन पथ सहित कई अंगों को प्रभावित करने के लिए एक रोग में उत्परिवर्तन,युवा वयस्कों में dity और मृत्यु दर। फेफड़ों की बीमारी आम तौर पर आयोजित करने एयरवेज की सतह उपकला पर CFTR समारोह के नुकसान के कारण होता है सिस्टिक फाइब्रोसिस में मृत्यु दर और ज्यादातर मामलों में खातों। रोमक श्वसन उपकला के शिखर सतह पर तरल पदार्थ की परत को संशोधित करने के लिए सतह उपकला भर में और पानी के आंदोलन – CFTR क्लोराइड चैनल गतिविधि की कमी के कारण दोनों एक सीएल में कमी का कारण बनता है। इस रोमक श्वसन उपकला कोशिकाओं की क्षमता impairs कि एक चिपचिपा airway के सतह तरल में परिणाम वायुमार्ग से बाहर प्रभावी ढंग से स्पष्ट रोगजनकों के लिए। एक परिणाम के रूप में, सबसे सीएफ रोगियों फेफड़ों के संक्रमण और सूजन की वजह से फेफड़ों को नुकसान की आवर्तक मुकाबलों से ग्रस्त हैं।
जैसी कि उम्मीद थी, सामान्य CFTR प्रोटीन की कार्रवाई के तंत्र के अध्ययन मुख्य रूप से अपने चैनल gating गतिविधि का विस्तृत electrophysiological पढ़ाई पर ध्यान केंद्रित किया। एक चैनल के अध्ययन के एक PKA निर्भर सीएल के रूप में सीधे कि CFTR कार्यों से पता चला है– एक एटीपी विनियमित गेट दो के पास जो चैनल। अध्ययन किया गया है कि किसी विशेष एक चैनल की विशेषताओं इसलिए पूरे CFTR चैनलों की आबादी और एक चैनल को प्रतिबिंबित करता है कि क्या करने के रूप में विस्तृत electrophysiological पढ़ाई एकल CFTR चैनलों 1,3 के बारे में जानकारी का एक बड़ा सौदा प्रदान करते हैं, हालांकि चिंता का विषय हो सकता है परिणाम हमेशा स्थूल जनसंख्या का अध्ययन करने के तरीकों के साथ-साथ विचार किया जाना चाहिए। शुद्ध CFTR की आबादी चैनल गतिविधि के प्रत्यक्ष परख रोग के कारण परिवर्तन के साथ जुड़े आणविक दोष में अंतर्दृष्टि प्रदान करने और रासायनिक modulators के जो मरम्मत उत्परिवर्ती CFTR प्रोटीन की खोज के लिए ड्राइव करने की क्षमता है। तिथि करने के लिए, सिस्टिक फाइब्रोसिस चार पैदा करने के बारे में सोचा CFTR में 1900 विभिन्न म्यूटेशन से अधिक कर रहे हैं। उत्तरी अमेरिका और यूरोप में रोगियों के लगभग 90% में कम से कम एक एलील पर पाया प्रमुख उत्परिवर्तन, F508del-CFTR, प्रोटीन एक misfolding की ओर जाता हैendoplasmic जालिका 5 में एन डी प्रतिधारण। F508del-CFTR भी दोषपूर्ण चैनल गतिविधि 6-9 सहित अन्य परिणाम है। कोशिका की सतह से CFTR की परिणामी अभाव गंभीर बीमारी के साथ जुड़ा हुआ है। G551D-CFTR, एक कम आम उत्परिवर्तन, ठीक से अभी तक मुड़ा कोशिका की सतह 6 बजे एक क्लोराइड चैनल के रूप में बेकार है माना जाता है। छोटे अणु correctors और potentiators के विकास क्रमशः, कोशिका की सतह पर जब वर्तमान तह और / या ऐसी कोशिका की सतह को F508del-CFTR के रूप में म्यूटेंट की तस्करी, और potentiating को सही या ऐसे G551D के रूप में म्यूटेशन के चैनल गतिविधियों में वृद्धि का लक्ष्य है । 150 मिलीग्राम सीएफ रोगियों> 6 साल में कम से कम एक G551D साथ में हर 12 घंटे में इस्तेमाल किया जा रहा है vx-770); correctors vx-809 और vx-661 (अभी तक रोगियों में उपयोग के लिए, potentiator Kalydeco (ivacaftor अनुमोदित नहीं कर रहे हैं -CFTR उत्परिवर्तन, और अधिक हाल ही में रोगियों के लिए G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255P से एक के साथऔर G1349D। Kalydeco सीएफ बीमारी 10 के नैदानिक उपायों, इस छोटे अणु की कार्रवाई की लेकिन तंत्र खराब रोगियों में उपयोग के लिए एफडीए अनुमोदन के समय में समझ में आ गया था के सुधार में सुरक्षित और परिणाम दोनों है।
CFTR शुद्धि तरीकों में से एक मुट्ठी भर पहले से पूरा करने के लिए समय के एक काफी लंबाई की आवश्यकता होती है, जिनमें से कई 2,11-18, वर्णित किया गया है। हाल ही में एक प्रकाशन 19 में, एक अद्वितीय तेजी से शुद्धि और पुनर्गठन विधि एस एफ 9 सेल अभिव्यक्ति प्रणाली में overexpressed CFTR के लिए वर्णित किया गया था, और परिभाषित लिपिड प्रणालियों में इस शुद्ध प्रोटीन CFTR की आबादी के लिए एक CFTR halide चैनल गतिविधि परख विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अणुओं। परख CFTR समारोह पर फास्फारिलीकरण, न्यूक्लियोटाइड और अवरोधकों के ज्ञात प्रभाव का स्मरण दिलाता है। प्रणाली potentiator के प्रभाव से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया गया था vx-770 / Kalydeco Wt- (जंगली प्रकार) पर, F508del- और G551D-CFTR और यह पहली बार के लिए दिखाया गया थादवा के लिए एक बड़ी आबादी के नजरिए से CFTR और न्यूक्लियोटाइड और छोटे अणुओं के साथ म्यूटेंट की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इन तरीकों की उपयोगिता और प्रयोज्यता का प्रदर्शन, एक एटीपी स्वतंत्र तरीके से अपने चैनल गतिविधि शक्ति प्रदान करने के लिए CFTR प्रोटीन के साथ सीधे संपर्क रखता है कि समय प्रोटीन के बारे में नैदानिक प्रासंगिक सवालों के जवाब। तरीकों में भी अन्य potentiator अणु और उनके डेरिवेटिव 20, साथ ही प्रोटीन 21 की गतिविधि पर एक छोटा सा अणु पढ़नेवाला के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
तपका assays के पहले से इलेक्ट्रोड, रेडियोधर्मी tracers और fluorophores 22,23 का उपयोग करते हुए पूरे सेल assays के, आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड 24 के साथ झिल्ली पुटिकाओं सहित CFTR म्यूटेंट की गतिविधि और अपनी गतिविधि पर CFTR-modulatory यौगिकों के प्रभाव की जांच करने के लिए कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है , और रेडियोधर्मी tracers 25 के साथ पुनर्गठन CFTR शुद्ध। हालांकि वेंशुद्ध पुनर्गठन CFTR अध्ययन करने के लिए आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड के ई का प्रयोग पहली बार हाल ही में 19 की सूचना मिली थी। वर्तमान पद्धति का एक रूपांतर पुनर्गठन और Pseudomonas aeruginosa, एक आम सीएफ रोगज़नक़ में दो झिल्ली प्रोटीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया है। आयोडाइड तपका माप के साथ युग्मित शुद्ध ALGE बाहरी झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के इस ट्रांसपोर्टर 26 के माध्यम से ऋणात्मक alginate स्राव के लिए एक मॉडल का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। पुनर्गठन और आयोडाइड तपका माप एक मॉडल के इस प्रोटीन 27 से बैक्टीरियल भीतरी झिल्ली में लिपिड से जुड़े oligosaccharide स्थानान्तरण के लिए एक एच + निर्भर antiport तंत्र से पता चलता है कि प्रस्तावित किए जाने की अनुमति दी है जो विशुद्ध Wzx प्रोटीन, के लिए लागू किया गया था। एक एक देशी सब्सट्रेट के लिए उम्मीद कर सकते हैं की तुलना में दोनों ही मामलों में आयोडाइड कम throughput पर यद्यपि, anionic सब्सट्रेट के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया गया था। विधि ग के साथ अन्य प्रोटीन के लिए अनुकूलन के लिए उपयुक्त हो सकता हैऋणात्मक substrates के लिए ationic परिवहन या चालन रास्ते।
यहाँ एक तेजी से शुद्धिकरण प्रक्रिया CFTR प्रोटीन और परिभाषित लिपिड की proteoliposomes में इसके पुनर्गठन के लिए वर्णित है। तेजी से पुनर्गठन की प्रक्रिया को आसानी से शुद्धि में इस्तेमाल डिटर्जेंट के प्रकार यहां इस्तेमाल किया तरीकों से हटाने के लिए उत्तरदायी है या पुनर्गठन प्रक्रिया से पहले एक उपयुक्त डिटर्जेंट के लिए विमर्श किया जा सकता है, बशर्ते कि अन्य विधियों के द्वारा शुद्ध CFTR के साथ प्रयोग के लिए सिलवाया जा सकता है। शुद्ध और पुनर्गठन CFTR प्रोटीन का चैनल गतिविधि की माप के लिए आयोडाइड तपका विधि विस्तार से वर्णन किया गया है और इस विधि से प्राप्त किया जा सकता है कि कुछ खास परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेलुलर overexpression प्रणालियों की एक किस्म से, पूर्ण लंबाई, कार्यात्मक CFTR अलगाव के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल की एक सीमित संख्या में किया गया है। यह ATPase और तलीय दोहरी परत में एक चैनल माप सहित चैनल समारोह के प्रत्यक्ष ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
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