Introduction
Hjärtklaffsjukdom är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet i västvärlden; dess utbredning ökar med åldern och det påverkar mer än 10% av befolkningen 75 år och äldre 1. Ventilerna i systemdelen av hjärtat, aorta och mitralis ventiler, är oftast drabbade. Hjärtklaff sjukdom kännetecknas av förlust av den mycket organiserad struktur av ventilerna, vilket resulterar i förändring av de mekaniska egenskaperna 2. Den strukturella integriteten är därför avgörande för funktionen av ventilen.
Broschyrer av ventilen består av valvulär interstitiella celler (VIC), valvulär endotelceller (VEC) och extracellulära matrix, som är mycket organiserad i en skiktad mönster 3,4. VICS ansvarar för ECM syntes, nedbrytning och organisation. Faktorer som härrör från blodet, EC eller bosatta i ECM agera på VICS iscensätta sin funktion. Dessutommekaniska krafter verkar på bipacksedeln under hjärtcykeln vilket resulterar i laminärt eller oscillerande skjuvspänning, tryck eller dragspänningar påverkar beteendet hos Vics 5.
För att förstå hur strukturen av ventilen regleras, måste det först förstått hur Vics svara på mångfald av stimuli upplevt under hjärtcykeln. In vitro-studier har varit mycket informativ om de egenskaper och förmågor klaffcellerna. Svaret hos dessa celler in vitro kan emellertid inte alltid exakt efterlikna svar in vivo 6; till exempel, är svaret från VIC på stimuli beroende av närvaron av EC och ECM sammansättning 5. Dessutom svaret från klaffcellerna för stimuli beror på deras specifika plats i broschyren 7. Förutom biokemiska stimuli, är beteendet hos klaff cellerna bestämdes genom mekaniska krafter som verkar on ventilen 8. Varje region av ventilen utsätts för en egen uppsättning av hemodynamiska påkänningar. Även om nuvarande ex vivo-modeller har visat att mekaniska krafter är viktiga faktorer för klaffstruktur 5, tillhörande mekanismer är fortfarande oklart. Medan in vivo-modeller har gett insikt i de molekylära mekanismerna bakom klaff utveckling 9,10, är fortfarande svårfångade insikter vuxna klaff biologi.
Därför gjordes en ex vivo flödesmodell utvecklad i vilken hjärtklaffar kan odlas i sin naturliga ställning i hjärtat under en utsträckt tidsperiod 11. Detta har den fördelen att ventilerna förblir i sin naturliga konfiguration och VICS upplever samma miljö som in vivo, vilket gör VICS svar på stimuli så naturligt som möjligt. Dessutom kulturen av ventilerna i deras naturliga läge i hjärtat underlättar utsätta varjeklaff region till relevanta hemodynamiska påfrestningar. I denna ex vivo-modell, det vill säga, Miniature Tissue Culture System (MTCS), ventilerna kan utsättas för olika biokemiska och hemodynamiska stimuli som möjliggör undersökning av deras roll i hjärtklaff ombyggnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer LUMC riktlinjer djurforskningsetisk kommitté.
1. Framställning av instrument, odlingsmedium, och MTCS
Obs: Utför alla förberedelser i laminärt flöde huva. Den MTCS perfusionskammare, bubbelfällan och stå beskrivs i Lieber et al. 2010 11.
- Desinficera pincett och mikro sax med 70% etanol. Förbered en 5 ml spruta med 21G nål med steril Tyrodes buffert (130 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 6,0 mM Hepes, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM glukos, 1,5 mM CaCl2 .2H 2 O, pH = 7,2). Förbered en 5 ml spruta med 21G nål med steril KCl-lösning (100 mM).
- Bered 65 ml medium per hjärta: DMEM kompletterat med 10% fetalt kalvserum, antibiotika / antimykotika (A / A; 100 enheter penicillin, 100 | ig av streptomycin och 0,25 ug av amfotericin B / ml), insulin-Transferrin-Selen (ITS, 10 | j, g / ml insulin, 5,5 | ig / ml transferrin, 6,7 ng / ml natriumselenit) och filtrera sterilisera.
- Sterilisera perfusionskammaren och bubbelfällan genom besprutning med 70% etanol och torka med hushållspapper. Montera MTCS (figur 1D) emellertid initialt utan perfusionskammaren. Placera bubbelfälla på stativet. Använd en peristaltisk rullpump med lätt belastning pumphuvuden.
- Använda kisel slang göra kopplingar mellan behållaren (50 ml rör) och pumpen, pump och bubbelfällan, bubbelfällan och reservoar (se figur 1D). Gör slangen inuti inkubatorn tillräckligt långa för att medium för att nå gas jämvikt med gasen i inkubatorn genom det gaspermeabla silikonslangen (1 m) och slangen utanför inkubatorn så kort som möjligt.
- Fyll 50 ml rör med 70% etanol, slå på pumpen (flödeshastighet ca 1 ml / min för att tillåta ordentlig cirkulation) och låt etanol cirberäkna i 30 min för att sterilisera alla slangar. Avlägsna etanolen genom att tömma behållaren och pumpar ut etanolen från systemet.
- Fyll 50 ml rör med sterilt destillerat vatten, slå på pumpen och låt vattnet cirkulerar under 30 minuter för att bli av kvarvarande etanol. Avlägsna vattnet genom att tömma behållaren och pumpa ut vatten från systemet.
- Fyll 50 ml rör med 45 ml medium, sätta stativet i inkubatorn. Sätt på pumpen (flödeshastighet ca 1 ml / min) och cirkulera mediet för att fylla alla slangar, ta bort alla luftbubblor och tillåta mediet att anpassa sig till gassammansättningen i inkubatorn under minst en timme. Bibehåll inkubator vid standardvävnadsodlingsbetingelser (5% CO 2 och 37 ° C). Se till att inga bubblor är närvarande i slangen.
2. Isolering av mus Hjärta
- Injicera musen med 500 enheter Heparin. Detta kommer att förhindra att blodet från att levra och tillåter avlägsnande av bLood från hjärtat. Efter 10 minuter, söva musen i en induktionskammare med 4% isofluran med användning av en precisions förångaren. Anestesi är tillräcklig när musen inte svarar på tå nypa.
- Överför musen till en dissektion bräda och upprätthålla anestesi medelst en ansiktsmask är ansluten till en koaxial krets. Desinficera päls på musen med 70% alkohol. Med sax öppna bukhålan att exponera vena cava och membran.
- Att exponera hjärtat, göra sido snitt med början från den sista till första revbenen och återspeglar bröstkorgen över mus huvud. Stoppa anestesi som musen inte andas längre. Observera hjärta slå.
- För in 21G nål fäst vid en 5 ml spruta innehållande steril Tyrodes buffert in i vena cava inferior från buken in i brösthålan (genom membranet). Försäkra dig om att blod kan gå ur hålvenen caudal från nålen insättningen. Perfundera the Tyrodes buffert försiktigt och med konstant tryck i vena cava tills hjärtat förlorar delvis dess röda färg. Obs: Hjärtat förblir slå tillåter avlägsnandet av blod från hjärtat.
- Byt ut nålen med 21G nål fäst vid en 5 ml spruta innehållande steril KCl-lösning. BEGJUTA försiktigt KCl-lösning i hålvenen tills hjärtat slutar slå och ta bort nålen. Obs! KCl-lösning bevarar hjärtat i den avslappnade diastoliska fasen, vilket kommer att göra det lättare att införandet av perfusion nålar och perfusion av kranssystemet.
- Lyft hjärtat med hjälp av böjda pincett och använda sax dissekera hjärta fri från omgivande vävnad, men lämnar artärer och vener proximala till hjärtat intakt och fäst på hjärtat. Överför hjärtat till en 15 ml rör innehållande iskall PBS kompletterad med antibiotika / antimykotika (A / A). Förvara hjärtat i iskall PBS under upp till 3 timmar.
3. Cannulation Mus Hearts i perfusionskammaren
- Utför alla förfaranden laminärt flöde huva. Överför den isolerade hjärtat från 15 ml rör till en 10 cm petriskål och tillsätt PBS kompletterad med A / A.
- Under ett dissektionsmikroskop, använda mikro sax och pincett för att avlägsna alla icke-hjärtvävnad men bevara aorta ascendens till åtminstone bifurkationen med brachiocephalic artären och lungvenerna, 2 mm proximalt till hjärtat. Skär av toppen på spetsen av hjärtat för att skapa tillgång till vänster kammar lumen (typiskt 2 mm). Placera perfusionskammaren i flödeshuven under dissektionsmikroskop.
- Bifoga en 5 ml spruta med medium till insatsen nålen med hjälp av silikonslangar. Fyll perfusionskammaren med 20 ml medium och sätta hjärtat på rotationssteget i mellan de 2 trubbiga nålar i perfusionskammaren (Figur 1). Justera höjden hos rotationssteget så att hjärtat är placerad framför dennålar.
4. Ligering för odling mitralventilen (se figur 1)
- Ligate aorta med sutur (siden 7,0). Ligate vänster förmak med sutur. Stick in nålen (nr. 1 i figur 1) genom lungvenen i vänster förmak och ligera med sutur proximalt till sin post i vänster förmak. Kontrollera att nålen är inte alltför långt in i vänster förmak, eftersom detta skulle skada mitralisklaffen.
- För in nålen (nr.2 i figur 1) med en linjär rörelse i den vänstra ventrikeln. Överför mediet från perfusionskammaren till en 50 ml rör. Täta nålen till hjärtmuskeln med biokompatibla lim.
- Efter limmet har torkat, försiktigt injicera mediet i hjärtat genom att ansluta en mellan förfylld spruta till nålen nr.1 och kontrollera om det finns något läckage. Se till att medel utgångar från nålen nr.2 och den sista kvarvarande blod perfusion av hjärtat.
5. Lidighet för odling aortaklaffen (se figur 1)
- Stick in nålen (nr.1 i figur 1) i aorta och ligera med sutur. Kontrollera att nålen är inte alltför långt in i aorta, eftersom detta skulle skada aortaklaffen. För in nålen (nr.2 i figur 1) med en linjär rörelse i den vänstra ventrikeln. Överför mediet från perfusionskammaren till en 50 ml rör. Täta nålen till hjärtmuskeln med biokompatibla lim.
- Efter limmet har torkat, försiktigt injicera mediet in i hjärtat genom att ansluta en mellan förfylld spruta till nålen nr.2 och kontrollera om det finns något läckage. Se till att medel utgångar från nålen nr.1 och den sista kvarvarande blod perfusion av hjärtat.
6. Placera perfusionskammare på stativ
- Fyll perfusionskammare med 20 ml överförda medium. Placera packningen och locket på kammaren och dra åt med bricka och skruv.
- Ta bort de församlade MTCS från incubator. Fäst perfusionskammaren på stativet. Anslut slangen (se figur 1D). Placera stativet i inkubatorn (5% CO2 och 37 ° C). Anslut slangen till pumpen. Slå på pumpen med flödeshastighet ca 600 ul / min.
- Se till att i behållaren och / eller bubbelfällan nivån hos mediet gör det möjligt för visualiseringar av närvaron av flödet av den fallande av de inkommande medel droppar. Efter odling, är hjärtat avlägsnas från systemet, fixerades och bearbetades för histologisk undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aortaklaffen (figur 2) eller mitralisklaffen 11 kan odlas under minst 3 dagar. Genom odling i det öppna läget (som representerar det systoliska positionen för aortaventilen och diastoliska positionen för mitralventilen), klaff cellerna förblir viabla. Ingen celldöd observeras såsom bestäms genom frånvaro av TUNEL-positiva celler (fig 2H, i) eller klyvs kaspas-3-uttryck (icke visad och Lieber et al., 2010 11). Kollagenfördelning (såsom visualiseras genom Massons Trikrom-färgning) liknar den nativa tillstånd vid odling i ett% serum (Figur 2D, E). Ventilerna är kunna anpassas till föränderliga odlingsbetingelser. Ökning av mängden serum till 10% resulterar i tjockare broschyrer (figur 2C). Vidare är en tydlig kollagenfritt område observeras vid ventrikel sida av bipacksedeln nära fastsättning på aortaväggen (pilen i figur 2F
Figur 1. Miniatyr Tissue Culture system. (A) i perfusionskammaren hjärtat om på rotations scenen och ligerades med trubbiga nålar anges med nr.1 och nr.2. (B) Perfusion kammaren är monterad på stativet. (C) Schematisk bild av hjärtat vid odling mitralisklaffen (vänster) eller aortaklaffen (höger). (D) Schematisk bild av installationen av systemet för aortaklaffen kultur ex vivo flöde. Denna siffra har delvis ändrats från tidigare studier 11. Klicka här för att se en större version of denna siffra.
Figur 2. Histologisk analys av odlade ventiler från 2 månader gamla möss. (AC) heamatoxylin och eosin (H & E) (DF) Massons Trikrom-färgning och GI) TUNEL-färgning av ett icke-odlad aortaventilen (A, D, G), en aortaventil odlades i närvaro av 1% serum (B, E , H) eller 10% serum (C, F, I) i 3 dagar i MTCS. Ventilen odlades med 1% serum tycks jämförbar med icke-odlade ventil, under det att ventilen odlades med 10% serum är tjockare (C) och har ett förändrat ECM mönster (F). Ingen apoptos observeras i ventilerna (GI). Skala bar är 100 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i odling av hjärtklaffar mus hör att göra tiden mellan utskärning av hjärtat från musen och ligeringen i perfusionskammaren så kort som möjligt för att säkerställa livsduglighet och ligering av nålarna vinkelrätt till ventilerna för att säkerställa korrekt flödesriktningen . Dessutom, kontrollera flödet efter ligering i perfusionskammaren utan mediet garanterar korrekt insättning och ligering av nålar. Det är kritiskt att upprätthålla en steril kultur och förhindra luftbubblor i slangen, vilket potentiellt skulle kunna fastna i hjärtat hindrar flödet.
Den totala volymen av medium som används för perfusion av ett hjärta är 45 ml (observera att det medium som perfunderas genom hjärtat inte är i kontakt med de 20 ml medium i perfusionskammaren). För tillsats av exempelvis virus en mindre volym kan vara föredragna. Tidsmässigt reservoaren (och en del av röret) kan avlägsnas från kretsen leaving 5-7 ml i systemet för att tillåta infektion av ventilen.
Frånvaron av att hjärtat slår kunde anses vara en begränsning. Men gör det möjligt att skapa en experimentell tillstånd där alla stimuli som arbetar på bipacksedeln kan hållas konstant. Detta ger en unik möjlighet att studera effekten av en enda ändring. Vid behov av rörliga ventiler, kan ett pulserande flöde skapas.
För att studera valvulär biologi och den roll som molekylära, cellulära och mekanisk stimuli på ventilen, kan modifieringar lätt göras till odlingssystemet. Molekylär modifiering kan åstadkommas genom tillsats av tillväxtfaktorer, kemiska föreningar och virus som förmedlar genleverans 11 till perfusionsmediet. En eller flera celltyper kan administreras till perfusionsmediet att undersöka inverkan av dessa celler på klaff biologi eller deras bidrag till ventilen. Inverkan av oxidativ stress eller hypoxi kan varastuderades genom ändring av syretrycket i odlingsmediet. De hemodynamiska påkänningar på ventilen kan varieras genom ändring av flödeshastighet, flödesriktning, flöde pulsatilitet och viskositeten. Den totala morfologi kan granskas (Figur 2B, C) med H & E, histokemisk och immunofluorescerande färgning. Dessutom organisationen och sammansättningen av ECM, fenotypen, spridning och lönsamhet av klaff cellerna och aktivering av signalvägar ge insikt om effekterna av varierande dessa villkor. Genetiskt modifierade möss kan användas för att spåra endotelcellerna, med hjälp av endotelceller reporter möss (med Tie2-Cre och floxed reporter möss) indikerar närvaron av endotel till mesenkymala omvandling eller möss med förlust eller vinst på funktion av specifika signalvägar. Totalt sett är systemet presenteras här ett användbart verktyg för att studera hjärt klaff biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N.
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
