הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable
Summary
בעוד התחבורה של חלבונים בתא שטח נלמדת בקלות יחסית, לדמיין את הסחר של חלבונים תאיים הוא הרבה יותר קשה. כאן, אנו משתמשים בשילוב מבני GFP photoactivatable ולהפגין שיטה לעקוב במדויק את החלבון המוצא לעמילואיד מהמערכה גולג'י לתאים למטה זרם ועיקבו אחרי שחרורה.
Abstract
ביתא-עמילואיד (Aβ) הוא המרכיב המרכזי של סנילי לוחות שנמצאו במוחם של החולים במחלת האלצהיימר. Aβ נגזר מהמחשוף רציף של חלבון עמילואיד מבשר (APP) על ידי β וγ-secretases. למרות חשיבותו של Aβ לפתולוגיה לספירה, לוקליזציה subcellular של שסעים אלה אינה מבוססת היטב. עבודה במעבדה שלנו ואחרים לסבך את מערכת endosomal / lysosomal בעיבוד APP לאחר הפנמה מתא השטח. עם זאת, הסחר תאיים של APP הוא יחסית understudied.
בעוד חלבונים על פני קרום התא הם amendable לטכניקות תיוג רבים, אין שיטות פשוטות לבעקבות הסחר של חלבונים בממברנה מGolgi. לשם כך, יצרנו מבני APP שתויגו עם GFP צילום activatable (paGFP) בC-הסופית. לאחר סינתזה, יש paGFP הקרינה בסיס נמוכה, אבל זה יכול להיות מגורה עם לא אור 413 ננומטרo לייצר הקרינה חזקה, יציבה ירוקה. על ידי שימוש בGolgi סמן Galactosyl transferase מצמידים את חלבון ציאן פלורסנט (גאלט-CFP) כמטרה, אנחנו מסוגלים APP מדויק photoactivate ברשת טרנס Golgi. אז יכול להיות אחרי מופעל-תמונות APP-paGFP כפי שtraffics לתאים במורד הזרם מזוהה עם fluorescently מתויג חלבוני סמן תא לאנדוזום מוקדם (Rab5), אנדוזום מאוחר (Rab9) והליזוזום (LAMP1). יתר על כן, שימוש במעכבים לעיבוד APP כולל chloroquine או L685 מעכב γ-secretase, 458, אנו מסוגלים לבצע ניסויי דופק מרדף לבחון את העיבוד של APP בתאים בודדים.
אנו מוצאים כי חלק גדול של APP נע במהירות להליזוזום מבלי להיראות על פני השטח של התאים, ולאחר מכן פינה מהליזוזום ידי שסעים כמו secretase. טכניקה זו ממחישה את התועלת של paGFP לבעקבות הסחר והעיבוד של חלבונים תאיים הלוך ושובמ 'Golgi לתאים במורד הזרם.
Introduction
סימן ההיכר של מחלת אלצהיימר (AD) הוא הנוכחות של פלאק סנילי וסבכים נוירו-פיברילריים (NFTS) במוח. המרכיב המרכזי של לוחות סנילי הוא β עמילואיד (Aβ). Aβ נגזר ממבשרה; חלבון המוצא לעמילואיד (APP) 1. מחשוף amyloidogenic של APP מתחיל בהסרת ectodomain מAPP על ידי β-secretase 2. בר מסוף carboxyl 99-השאריות שנותר (CTF) ניתן ביקע ידי γ-secretase לייצר Aβ 3-7. בעוד ניסויים רבים תעדו את המחשוף של שטח פני תא APP לאחר הפנמה מתא השטח למערכת endosomal / lysosomal, מספר המחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי סחר תאיים של APP הוא גם חשוב בויסות העיבוד שלה 8-11.
היו כמה ניסיונות בויסות הרמות של Aβ עם מעכבי γ-secretase וimmun Aβotherapies. עם זאת, ניסויים קליניים האחרונים בטיפולים אלה לא הראו שום תועלת, ו, במקרים מסוימים, גרם נזק 12. אסטרטגיה בלתי מנוצלת לווסת ייצור Aβ היא לשנות את לוקליזציה המשנה הסלולר של APP ואינטראקציה γ-secretase. Golgi, קרום פלזמה, וendosomes / lysosomes שכל הוצע כמקומות אפשריים לγ-מחשוף של APP. מחקר מהמעבדה שלנו מצביע על כך שAPP וγ-secretase הם חלבוני תושב קרום lysosomal 13. יתר על כן, מצאנו כי יש lysosomal γ-secretase pH האופטימלי חומצי 13. בנוסף, alkalization של מערכת endosomal / lysosomal עם chloroquine או NH 4 Cl, הוכח להפחית את הייצור של 14 Aβ. γ-secretase עיכוב או בנוקאאוט או presenilin מוביל להצטברות APP-CTFs ב15-17 הליזוזום. יתר על כן, שיבוש אנדוציטוזה APP מוריד ייצור Aβ 18-20.
למרות חשיבותו של Golgi כתחנת מיון לחלבונים וחלבונים ממוחזרים ממערכת endosomal / lysosomal המתהווים, הסחר תאיים של APP לא נחקר בפירוט 21. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי APP יכול להיות ממוחזר לרשת טרנס Golgi (TGN) באמצעות אינטראקציה עם מורכב retromer. רגולציה כלפי מטה של מתחם retromer מפחיתה את ייצור Aβ 8,22-24. עם זאת, היציאה של APP מGolgi לא נחקרה היטב.
בעוד הבא אנדוציטוזה של חלבונים על פני קרום התא, כגון קולט transferrin, מתויגים בקלות ואחריו, בעקבות הסחר של חלבונים תאיים הוא מאתגר יותר. למעשה, כמה חלבונים יש לי הסחר תאיים שלהם צילם. כניסתו של תגי חלבון פלואורסצנטי, כגון צילום activatable-GFP (paGFP), סיפקה כלים חדשים לבחינת סחר תאית. תמונה-activatable-GFP הוא צורה של GFP שהוא כמעט בלתי נראה לאחר סינתזה, אבל מפתחת ירוקה הקרינה חזקה (GFP) לאחר שהופעל על ידי 413 אור לייזר ננומטר והאיתותים יציבה לימים 25,26. מבנים באמצעות paGFP שימשו כדי להדגים את סחר intralysosomal של חלבון lysosomal חלבון קרום 1 (LAMP1) 25, מסירת השטח פני תא של וירוס שלפוחי Stomatitis גליקופרוטאין (VSVG, סמן של מסלול ההפרשה) 27, והמחזור של peroxisomes 28 וautophagosomes 29.
על מנת להמחיש את המיון של APP מTGN בתאים חיים, עיצבנו פלסמיד המבטא את 112 חומצות אמינו האחרונות של APP מצמידים את התמונה-activatable (paGFP) על C-המסוף (מכונה βAPP-paGFP) 30. יש לנו גם ביצעתי ניסויים אלה עם APP באורך מלא והשיגו תוצאות דומות; מבנה ΒAPP משמש כאן משום שהוא מספק תמונות בהירות. לאחר מכן, אנו צילום הפעל ו# 946; APP-paGFP רק בTGN, כמוגדר על ידי TGN סמן Galactosyltransferase (גאלט). למרות APP כבר תויג עם paGFP לדמיין תחבורה מהירה axonal של APP ואישור מאזור perinuclear, זה ההפגנה הראשונה של סחר APP מאחד תא מוגדר בזהירות ל11,31,32 אחר. הנה, אנחנו מדגימים תמונה-הפעלה מדויקת בתוך TGN ויציאה של APP לתאים במורד הזרם ומחשוף שלאחר מכן ואישור מlysosomes 30. צילום ההפעלה מדויקת בתוך Golgi היא נרחב החלים על מערכות חלבון אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקה זו מתארת את התמונה-ההפעלה מדויקת של חלבוני קרום מתויגים עם paGFP בTGN לדמיין סחר ומחשוף שלאחר מכן. בעוד paGFP נוצר לפני למעלה מעשור 25, זה הוא הדוגמא הראשונה של תמונה-הפעלה מדויקת למעקב הסחר של חלבונים המתהווה לתאים במורד הזרם. מחקרים קודמים באמצעות APP-paGFP בונ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
References
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer’s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al. Prediction of ‘aggregation-prone’ and “aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer’s disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer’s disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer’s amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the ‘Swedish’ amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase”;site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
