في حين يتم نقل البروتينات سطح الخلية درس بسهولة نسبيا، تصور الاتجار البروتينات داخل الخلايا هو أكثر صعوبة بكثير. هنا، فإننا نستخدم بنيات دمج GFP photoactivatable ويبرهن على وجود طريقة لمتابعة بدقة بروتين اميلويد السلائف من جهاز جولجي إلى المقصورات أسفل مجرى وتابع إزالة لها.
بيتا اميلويد (Aβ) هو المكون الرئيسي لويحات خرف وجدت في أدمغة مرضى الزهايمر. مشتق Aβ من انشقاق متتابعة من اميلويد السلائف البروتين (APP) من خلال β وγ-secretases. وعلى الرغم من أهمية Aβ إلى AD علم الأمراض، لا راسخة توطين التحت خلوية من هذه الانقسامات. العمل في مختبرنا وغيرها توريط النظام endosomal / الليزوزومية في معالجة APP بعد استيعاب من سطح الخلية. ومع ذلك، فإن الاتجار داخل الخلايا APP هو دراسة سلوكه نسبيا.
بينما البروتينات على سطح الخلية قابلة للتعديل إلى العديد من التقنيات وصفها، لا توجد طرق بسيطة لمتابعة الاتجار بروتينات الغشاء من جولجي. تحقيقا لهذه الغاية، أنشأنا بنيات APP التي تم الموسومة ب-صورة activatable GFP (paGFP) في محطة سي. بعد التوليف، paGFP ديها منخفضة مضان القاعدية، ولكن يمكن حفز مع 413 نانومتر ضوء رس إنتاج، مخضر قوي مستقر. باستخدام جولجي علامة Galactosyl ترانسفيراز بالإضافة إلى البروتين سماوي نيون (جالت-CFP) كهدف، ونحن قادرون على APP photoactivate بدقة في شبكة عابرة للجولجي. تنشيط الصور APP-paGFP ثم يمكن اتباعها لأنها بالاتجار إلى حجرات المصب تحديدها مع الموسومة fluorescently البروتينات علامة المقصورة لالاندوسوم في وقت مبكر (Rab5)، المرحوم الاندوسوم (Rab9) ويحلول (LAMP1). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام مثبطات لمعالجة APP بما في ذلك الكلوروكين أو γ-secretase المانع L685، 458، ونحن قادرون على إجراء تجارب نبض مطاردة لدراسة تجهيز APP في الخلايا وحيدة.
نجد أن نسبة كبيرة من APP يتحرك بسرعة ليحلول دون الظهور على سطح الخلية، ومن ثم يتم مسح من يحلول من قبل الانشقاقات مثل secretase. توضح هذه التقنية فائدة paGFP لمتابعة الاتجار وتصنيع البروتينات داخل الخلايا جيئة وذهابام غولجي إلى حجرات المصب.
السمة المميزة لمرض الزهايمر (AD) هي وجود لويحات خرف والتشابك الليفي العصبي (NFTS) في الدماغ. الرئيسية المكونة لويحات خرف هو بيتا اميلويد (Aβ). مشتق Aβ من السلائف. بروتين اميلويد السلائف (APP) 1. الانقسام amyloidogenic من APP يبدأ مع إزالة ectodomain من APP التي كتبها β-secretase 2. ما تبقى من 99 محطة بقايا الكربوكسيل جزء (CTF) يمكن المشقوق من قبل γ-secretase لإنتاج Aβ 3-7. بينما العديد من التجارب وقد وثقت الانقسام من سطح الخلية APP بعد استيعاب من سطح الخلية في نظام endosomal / الليزوزومية، وعدد من الدراسات الحديثة قد اقترح أن الاتجار داخل الخلايا APP مهم أيضا في تنظيم التجهيز لها 8-11.
كان هناك عدد من محاولات تحوير مستويات Aβ مع مثبطات-γ secretase وAβ إمانotherapies. ومع ذلك، أظهرت التجارب السريرية الأخيرة مع هذه العلاجات لا فائدة، وفي بعض الحالات تسبب الضرر 12. استراتيجية غير المستغلة لتعديل إنتاج Aβ هو تغيير التعريب شبه الخلوية من APP والتفاعل γ secretase. كلها قد اقترح جولجي، غشاء البلازما، والإندوسومات / الجسيمات الحالة كما غات الممكنة لγ-انشقاق من APP. البحث عن المختبر لدينا تشير إلى أن APP وγ-secretase هي البروتينات المقيمة للغشاء الليزوزومية 13. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن الليزوزومية γ-secretase لديه درجة الحموضة المثلى الحمضية 13. بالإضافة إلى ذلك، قلونة النظام endosomal / الليزوزومية مع الكلوروكين أو NH 4 الكلورين، وقد تبين أن ينخفض إنتاج Aβ 14. جاما-secretase تثبيط أو بالضربة القاضية أو Presenilin يؤدي إلى تراكم APP-كتفس في يحلول 15-17. وعلاوة على ذلك، وتعطيل APP الإلتقام يخفض Aβ إنتاج 18-20.
وعلى الرغم من أهمية جولجي كمحطة الفرز للبروتينات الوليدة والبروتينات المعاد تدويرها من النظام endosomal / الليزوزومية، لم يدرس الاتجار داخل الخلايا APP بالتفصيل 21. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي APP يمكن إعادة تدويرها إلى الشبكة العابرة للجولجي (TGN) عن طريق التفاعل مع مجمع retromer. تنظيم الأسفل من مجمع retromer ينخفض إنتاج Aβ 8،22-24. ومع ذلك، فإن الخروج من APP من جولجي لم يتم دراستها جيدا.
بينما بعد الإلتقام من البروتينات على سطح الخلية، مثل مستقبلات ترانسفيرين، وصفت بسهولة وتلت ذلك، في أعقاب الاتجار البروتينات داخل الخلايا هو أكثر تحديا. في الواقع، فإن القليل من البروتينات الاتجار بهم داخل الخلايا تصوير. وقد وفرت ظهور علامات بروتين فلوري، مثل الصورة activatable-GFP (paGFP)، وأدوات جديدة لدراسة الاتجار داخل الخلايا. الصور activatable-GFP هو شكل من أشكال GFP التي هي غير مرئية تقريبا بعد التوليف، ولكن تطور قوي الأخضر (GFP) مضان بعد أن تفعيلها من خلال 413 نانومتر ضوء الليزر وهذه إشارة غير مستقرة لعدة أيام 25،26. وقد استخدمت بنيات باستخدام paGFP للتدليل على الاتجار intralysosomal من البروتين الليزوزومية بروتين الغشاء 1 (LAMP1) 25، وتسليم سطح الخلية من إلتهاب الفم التقرحي الفيروسات البروتين السكري (VSVG، علامة على مسار إفرازية) 27، ودوران peroxisomes 28 وautophagosomes 29.
من أجل تصور فرز APP من TGN في الخلايا الحية، قمنا بتصميم البلازميد معربا عن مشاركة 112 الأحماض الأمينية من APP بالإضافة إلى الصور activatable (paGFP) على C-محطة (المشار إليها باسم βAPP-paGFP) 30. لقد قمنا أيضا هذه التجارب مع كامل طول APP وحققت نتائج مماثلة؛ يتم استخدام بناء ΒAPP هنا لأنها توفر صورا أكثر إشراقا. نحن بعد ذلك الصور وتفعيل# 946؛ APP-paGFP فقط في TGN، كما رسمتها TGN علامة Galactosyltransferase (جالت). على الرغم من APP تم الموسومة ب paGFP لتصور النقل محواري السريع لAPP والتخليص من منطقة محيط بالنواة، وهذا هو اول دليل على الاتجار APP من احد المقصورة محددة بعناية ل11،31،32 آخر. هنا، علينا أن نظهر دقة الصورة التنشيط داخل TGN والخروج من APP إلى أقسام المصب والانقسام اللاحق والتخليص من الجسيمات الحالة 30. في دقيقة الصور التنشيط داخل جولجي ينطبق على نطاق واسع لأنظمة البروتين الأخرى.
توضح هذه التقنية على دقة الصور تفعيل بروتينات غشاء الموسومة ب paGFP في TGN لتصور الاتجار والانقسام لاحق. في حين تم إنشاء paGFP أكثر من عشر سنوات 25، وهذا هو المثال الأول من دقيق الصور تفعيل لمتابعة الاتجار البروتينات الوليدة إلى حجرات المصب. الدراسات السابقة باستخدام A…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
Imaris | Bitplane | with colocalization package |