Embora o transporte de proteínas de superfície celular está relativamente facilmente estudado, visualizando o tráfico de proteínas intracelulares é muito mais difícil. Aqui, usamos construções que incorporam GFP fotoactivável e demonstrar um método para seguir com precisão a proteína precursora de amilóide do aparelho de Golgi para compartimentos a jusante e siga a sua depuração.
Beta-amilóide (Ap) é o constituinte principal das placas senis encontradas nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer. Ap é derivado da clivagem sequencial da Proteína Precursora Amilóide (APP) por β e y-secretases. Apesar da importância de Ap a patologia da DA, a localização subcelular destas clivagens não está bem estabelecida. Trabalhar em nosso laboratório e outros implicam o sistema endossomal / lisossomal no processamento de APP após a internalização da superfície da célula. No entanto, o tráfego intracelular da APP é relativamente pouco estudada.
Embora as proteínas da superfície celular são alteráveis a muitas técnicas de marcação, não existem métodos simples para seguir o tráfico de proteínas de membrana a partir do Golgi. Para este fim, criada construções de APP que foram marcados com foto-activável GFP (paGFP) na extremidade C-terminal. Após a síntese, paGFP tem baixa fluorescência basal, mas pode ser estimulado com luz de 413 nm, to produzir uma fluorescência verde forte, estável. Ao utilizar o marcador de Golgi galactosiltransferase acoplados à proteína fluorescente ciano (GalT-PCP) como um alvo, que são capazes de APP com precisão fotoactivar na rede trans-Golgi. Photo-ativado APP-paGFP pode então ser seguido, uma vez que trafica para compartimentos jusante identificados com fluorescente etiquetado proteínas marcadoras compartimento para o endossomo precoce (Rab5), o falecido endosome (Rab9) e do lisossoma (LAMP1). Além disso, o uso de inibidores do processamento de APP, incluindo o inibidor de cloroquina ou L685 γ-secretase, 458, que são capazes de realizar experiências pulse-chase para examinar o processamento de APP em células individuais.
Descobrimos que uma grande fracção da APP move-se rapidamente para o lisossoma sem aparecer na superfície da célula, e é então eliminado do lisossoma por clivagens-secretase semelhantes. Esta técnica demonstra a utilidade de paGFP para seguir o tráfico e processamento de proteínas intracelulares from o Golgi para compartimentos a jusante.
A característica da doença de Alzheimer (DA) é a presença de placas senis e emaranhados neurofibrilares (NFTs) no cérebro. O constituinte principal das placas senis é β-amilóide (Ap). Ap é derivado de seu precursor; proteína precursora de amilóide (APP) 1. A clivagem de APP amiloidog�ica começa com a remoção do ectodomínio de APP pela secretase β-2. O fragmento do terminal carboxilo de 99-resíduo remanescente (CTF) pode ser clivado pela secretase γ para produzir Ap 3-7. Enquanto muitas experiências documentaram a clivagem de APP na superfície celular após a internalização a partir da superfície da célula para o sistema endossomal / lisossomal, uma série de estudos recentes têm sugerido que o tráfico intracelular da APP também é importante na regulação da sua transformação 8-11.
Tem havido uma série de tentativas de modular os níveis de Ap com inibidores y-secretase e Ap Immunotherapies. No entanto, os ensaios clínicos recentes com essas terapias não mostrou nenhum benefício, e, em alguns casos, causaram danos 12. Uma estratégia inexplorada de modular a produção de Ap é alterar a localização sub-celular de APP e interacção γ-secretase. Os Golgi, membrana de plasma, e endosomes / lisossomos têm sido sugeridos como possíveis locais para γ-clivagem de APP. Pesquisas no nosso laboratório sugerem que a APP eo γ-secretase são proteínas residentes da membrana lisossomal 13. Além disso, verificou-se que o lisossomais γ-secretase tem um pH óptimo ácido 13. Além disso, a alcalinização do sistema endossomal / lisossomal com cloroquina ou NH4Cl, foi demonstrado para diminuir a produção de Ap 14. y-secretase inibição ou nocaute ou Presenilin leva ao acúmulo APP-CTFs no lisossoma 15-17. Além disso, interrompendo APP endocitose reduz a produção de Ap 18-20.
Apesar da importância do Golgi como uma estação de triagem para as proteínas e as proteínas reciclados a partir do sistema endossomal / lisossomal nascentes, o tráfico intracelular de APP não tem sido estudada em pormenor 21. Um trabalho recente demonstrou que a APP pode ser reciclado para a rede trans-Golgi (TGN), através de interacção com o complexo retromer. Regulação para baixo do complexo retromer diminui a produção de Ap 8,22-24. No entanto, a saída de APP a partir do Golgi, não tem sido bem estudada.
Ao seguir a endocitose de proteínas de superfície celular, tais como o receptor de transferrina, são facilmente identificados e seguidos, após o tráfico de proteínas intracelulares é mais difícil. Na verdade, poucas proteínas tiveram seu tráfego intracelular trabalhada. O advento das marcas de proteínas fluorescentes, tais como foto-activável-GFP (paGFP), tem proporcionado novas ferramentas para examinar o tráfico intracelular. Photo-activatable-GFP é uma forma de GFP que é quase invisível após a síntese, mas desenvolve verde forte (GFP) de fluorescência depois de ser ativado por 413 nm de luz laser e este sinal é estável durante dias 25,26. Constructos usando paGFP têm sido utilizados para demonstrar o tráfico intralisossomal da proteína lisossómica proteína de membrana 1 (LAMP1) 25, a entrega da superfície da célula do vírus da estomatite vesicular glicoproteína (VSVG, um marcador da via secretora) 27, e o volume de peroxissomas 28 e 29 autofagossomas.
A fim de visualizar a triagem de APP do TGN em células vivas, que concebido plasmídeo expressando os últimos 112 aminoácidos da APP acoplados a foto-activável (paGFP) no terminal C (referida como pAPP-paGFP) 30. Também realizamos esses experimentos com APP de comprimento total e alcançou resultados semelhantes; a construção pAPP é usado aqui porque fornece imagens mais brilhantes. Em seguida, foto-activate &# 946; APP-paGFP apenas no TGN, como demarcada pela TGN marcador Galactosiltransferase (GalT). Embora APP foi marcado com paGFP para visualizar o transporte axonal rápido da APP e autorização da região perinuclear, esta é a primeira demonstração de tráfico de APP de um compartimento cuidadosamente definidos para outro 11,31,32. Aqui, nós demonstramos foto-ativação exata dentro do TGN ea saída de APP em compartimentos jusante e subsequente clivagem e apuramento de lisossomos 30. A foto-activação preciso dentro do Golgi é amplamente aplicável a outros sistemas de proteínas.
Esta técnica descreve a foto-ativação precisa de proteínas de membrana marcados com paGFP no TGN para visualizar tráfico e subsequente clivagem. Enquanto paGFP foi criada mais de uma década de 25, este é o primeiro exemplo de foto-ativação precisa de seguir o tráfico de proteínas nascentes para compartimentos jusante. Estudos anteriores utilizando APP-paGFP constrói uma região peri-nuclear da célula, a qual foi considerada o Golgi-11 activado foto. No entanto, como é evidente nas nos…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
Imaris | Bitplane | with colocalization package |