Воображение внутриклеточных торговли АРР с Фотоактивируемые GFP
Summary
В то время как транспортировка белков клеточной поверхности относительно легко изучены, визуализации оборота внутриклеточных белков намного сложнее. Здесь мы используем конструкции, включающие Фотоактивируемые GFP и продемонстрировать метод, чтобы точно следовать белка-предшественника амилоида из Гольджи вниз по течению отсеков и следить за его оформление.
Abstract
Бета-амилоид (Ар) является основным компонентом сенильных бляшек в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера. Ар вытекает из последовательного расщепления белка-предшественника амилоида (АРР) по р и у-секретазами. Несмотря на важность Ар к AD патологии, субклеточная локализация этих расколов не установлена. Работа в нашей лаборатории и другие вовлечь систему эндосом / лизосом в обработке APP после интернализации с клеточной поверхности. Тем не менее, внутриклеточный торговля APP относительно изученной.
В то время как поверхности клеток белки исправимо многих методов маркировки, нет простых методов для следующих торговлю мембранных белков из Гольджи. Для этого мы создали APP конструкции, которые были помечены с фото-активируемый GFP (paGFP) на С-конце. После синтеза paGFP имеет низкую базальную флуоресценции, но он может быть стимулированы 413 нм света тО производят сильное, стабильное зеленую флуоресценцию. При использовании Гольджи маркер галактозил трансферазы соединен с голубой флуоресцентный белок (GalT-CFP) в качестве цели, мы можем точно photoactivate АЭС в транс-Гольджи сеть. Фото-активированный АПП-paGFP то можно проследить, как это трафиков для последующих отсеках выявленных с флуоресцентно помечены отсек белки-маркеры для раннего эндосомы (Rab5), покойный ядрышко (Rab9) и лизосом (LAMP1). Кроме того, с помощью ингибиторов обработки АРР, включая хлорохин или γ-секретазы ингибитор L685, 458, мы в состоянии выполнить импульса погони эксперименты, чтобы изучить обработку АРР в одиночных камерах.
Мы считаем, что большая доля АЭС быстро движется к лизосом без появления на поверхности клеток, а затем удаляются из лизосом с секретазой, как расколов. Эта методика демонстрирует полезность paGFP для следующих торговлю и обработку внутриклеточных белков сюдам Гольджи к выходу отсеков.
Introduction
Отличительным признаком болезни Альцгеймера (AD) является наличие сенильных бляшек и нейрофибриллярных клубков (NFTs) в головном мозге. Основным компонентом сенильных бляшек является β-амилоида (Ар). Ар вытекает из ее предшественника; амилоидного белка-предшественника (АРР) 1. Амилоидогенного Расщепление АРР начинается с удаления эктодомена от АРР бета-секретазы 2. Остальные 99-остаток карбоксильной концевой фрагмент (CTF) может быть расщеплен гамма-секретазы, чтобы произвести Ар 3-7. В то время как многие эксперименты документально расщепление клеточной поверхности APP после интернализации с клеточной поверхности в системе эндосом / лизосом, ряд недавних исследований показали, что внутриклеточный торговля APP также важную роль в регуляции его обработку 8-11.
Там было несколько попыток модуляции уровней Ар с гамма-секретазы ингибиторов и Ар Immunotherapies. Однако недавние клинические испытания с этих методов не показали никакой пользы, и, в некоторых случаях, причинение вреда 12. Неиспользованными стратегия модулировать Ар производство является изменение субклеточные локализацию АРР и Г-секретазы взаимодействия. Гольджи, плазматической мембраны, и эндосомы / лизосомы все были предложены в качестве возможных местах для гамма-расщепления APP. Исследования, проведенные в нашей лаборатории предполагает, что приложение и γ-секретазы являются резиденты белки лизосом мембраны 13. Кроме того, мы обнаружили, что лизосомальные γ-секретазы имеет кислотную оптимальный рН 13. Кроме того, подщелачивание эндосом / лизосом системы с хлорохин или NH 4 Cl, как было показано, уменьшают продукцию Ар 14. Г-секретазы ингибирование или нокаут или пресенилин приводит к накоплению АПП-CTFS в лизосом 15-17. Кроме того, нарушая APP эндоцитоз снижает Ар производство 18-20.
Несмотря на важность Гольджи в сортировочной станции для ранних белков и белков переработанных из системы эндосом / лизосом, внутриклеточный торговля APP не изучен в деталях 21. Недавние работы показали, что приложение может быть возвращен в транс-Гольджи сеть (TGN) через взаимодействие с retromer комплекса. Вниз регулирование retromer комплекса снижает продукцию Ар 8,22-24. Тем не менее, выход из приложения с Гольджи не были хорошо изучены.
В то время как после эндоцитоза белков клеточной поверхности, таких как рецептор трансферрина, легко помечены и последующим, после оборота внутриклеточных белков является более сложным. На самом деле, несколько белков были их внутриклеточной торговля образ. Появление флуоресцентный белок тегов, таких как фото-активируемый-GFP (paGFP), предоставило новые инструменты для изучения внутриклеточного транспорта. Фото-активируемый-GFP является формой GFР, что является почти невидимым после синтеза, но и развивает сильный зеленый (GFP) флуоресценции после активации 413 нм лазерного света, и этот сигнал является стабильным в течение нескольких дней 25,26. Конструкции, использующие paGFP были использованы, чтобы продемонстрировать intralysosomal оборотом белка лизосомальных мембранный белок 1 (ЛАМПА1) 25, доставка клеточной поверхности везикулярного стоматита Касперского гликопротеин (VSVG, маркер секреторной пути) 27, а оборот пероксисом 28 и 29 аутофагосом.
Для того, чтобы визуализировать сортировку приложение из TGN в живых клетках, мы разработали плазмиды выражения последние 112 аминокислот АРР, соединенные с фото-активируемый (paGFP) на С-концевой (именуемые βAPP-paGFP) 30. Мы провели также эти эксперименты с полной длины APP и достигли подобных результатов; ΒAPP используется конструкция здесь, потому что он обеспечивает более яркие изображения. Мы тогда фото активировать и# 946; АПП-paGFP только в TGN, демаркированной TGN маркера галактозилтрансферазу (Galt). Хотя приложение было помечено с paGFP визуализировать быстрое аксонов транспорт АРР и разрешение от околоядерной области, это первая демонстрация торговли APP от одного четко определенной отсека в другой 11,31,32. Здесь мы демонстрируем точную фото-активацию в пределах TGN и выход из них APP в последующих отсеках и последующего расщепления и выведения из лизосом 30. Точное фотоактивация в Гольджи широко применимо к другим системам белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод описывает точную фото-активацию мембранных белков с меткой paGFP в TGN для визуализации последующее торговлей людьми и расщепление. В то время как paGFP был создан более десяти лет назад 25, это первый пример точного фото-активации следовать торговлей зарождающихся белков ни?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
References
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer’s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al. Prediction of ‘aggregation-prone’ and “aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer’s disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer’s disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer’s amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the ‘Swedish’ amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase”;site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
