Beeldvorming van de intracellulaire mensenhandel van APP met fotoactiveerbare GFP
Summary
Hoewel het transport van celoppervlak-eiwitten relatief gemakkelijk bestudeerd visualiseren van de handel in intracellulaire eiwitten is veel moeilijker. Hier gebruiken we constructen waarin activeerbare GFP en tonen een werkwijze om nauwkeurig volgen amyloïd precursor eiwit van het Golgi apparaat naar stroomafwaartse compartimenten en volg de klaring.
Abstract
Beta-amyloïde (AB) is het hoofdbestanddeel van seniele plaques in de hersenen van patiënten met de ziekte van Alzheimer. Aß wordt afgeleid van de opeenvolgende splitsing van Amyloid Precursor Protein (APP) van β en γ-secretasen. Ondanks het belang van Aß AD pathologie, de subcellulaire lokalisatie van deze splitsingen niet goed vastgesteld. Werken in ons laboratorium en anderen impliceren de endosomale / lysosomale systeem APP verwerking na internalisatie van het celoppervlak. Echter, de intracellulaire mensenhandel van APP is relatief weinig bestudeerd.
Terwijl celoppervlakte-eiwitten wijzigbaar vele labeltechnieken, er geen eenvoudige werkwijzen voor het volgen van het transport van membraaneiwitten uit de Golgi. Daartoe hebben we APP constructies die werden gelabeld met foto-activeerbare GFP (paGFP) aan de C-terminus. Na synthese paGFP een lage basale fluorescentie, maar kan worden gestimuleerd met 413 nm licht to produceren een sterke, stabiele groene fluorescentie. Via de Golgi marker galactosyltransferase gekoppeld Cyan Fluorescent Protein (GalT-GVB) als doelwit, kunnen wij nauwkeurig photoactivate APP in het trans-Golgi netwerk. Foto-geactiveerde APP-paGFP kan dan worden gevolgd als het trafieken aan downstream compartimenten geïdentificeerd met fluorescent gelabeld compartiment markereiwitten voor de vroege endosoom (Rab5), de late endosoom (Rab9) en de lysosomen (LAMP1). Bovendien gebruiken remmers APP verwerking zoals chloroquine of γ-secretase inhibitor L685, 458, kunnen wij pulse-chase experimenten met de verwerking van APP in individuele cellen te onderzoeken.
We vinden dat een groot deel van APP beweegt snel naar het lysosoom zonder dat het lijkt op het celoppervlak, en vervolgens uit het lysosoom gewist door secretase-achtige splitsingen. Deze techniek toont het nut van paGFP voor het volgen van de handel in en verwerking van intracellulaire eiwitten weerm de Golgi stroomafwaarts compartimenten.
Introduction
Het kenmerk van de ziekte van Alzheimer (AD) is de aanwezigheid van seniele plaques en neurofibrillaire tangles (NFT's) in de hersenen. Het belangrijkste bestanddeel van seniele plaques is β-amyloïde (AB). Aß wordt afgeleid uit zijn precursor; amyloïd precursor eiwit (APP) 1. De amyloidogenic splitsing van APP begint met het verwijderen van het ectodomein van APP door β-secretase 2. De overblijvende 99 residu carboxyl terminale fragment (CTF) kan worden gesplitst door γ-secretase Ap 3-7 te produceren. Hoewel veel experimenten de splitsing van APP celoppervlak hebben gedocumenteerd na internalisatie van het celoppervlak in het endosomale / lysosomale systeem een aantal recente studies hebben gesuggereerd dat intracellulair transport van APP is ook belangrijk bij de regulering van de verwerking 11/08.
Er zijn een aantal pogingen geweest bij het moduleren van de niveaus van Aß met γ-secretase remmers en Ap immunotherapies. Echter, recente klinische onderzoeken met deze therapieën vertoonden geen voordeel en, in sommige gevallen veroorzaakt schade 12. Een onbenutte strategie Ap moduleren is om de subcellulaire lokalisatie van APP en γ-secretase interactie veranderen. Het Golgi, plasmamembraan en endosomen / lysosomen zijn allemaal voorgesteld als mogelijke plekken voor γ-splitsing van APP. Onderzoek naar onze laboratorium blijkt dat APP en de γ-secretase woonachtig zijn eiwitten van het lysosomale membraan 13. Verder hebben wij gevonden dat de lysosomale γ-secretase een zure optimale pH 13. Bovendien alkalisering van de endosomale / lysosomale systeem met chloroquine of NH 4 Cl, is aangetoond dat de productie van Ap 14 verminderen. y-secretase remming of knockout of Preseniline leidt tot APP-CTFs ophoping in de lysosomen 15-17. Bovendien verstoren APP endocytosis verlaagt Ap productie 18-20.
Ondanks het belang van de Golgi als sorteerstation voor ontluikende proteïnen en eiwitten gerecycleerd uit de endosomale / lysosomale systeem, is de intracellulaire mensenhandel van APP niet in detail bestudeerd 21. Recent werk heeft aangetoond dat APP kan worden teruggevoerd naar het trans-Golgi netwerk (TGN) via interactie met de retromer complex. Neerwaartse regulatie van de retromer complex vermindert Aß productie 8,22-24. De uitgang van APP uit de Golgi is niet goed bestudeerd.
Hoewel na de endocytose van celoppervlakte-eiwitten, zoals de transferrinereceptor, gemakkelijk gelabeld en vervolgens, na het transport van intracellulaire eiwitten moeilijker. In feite hebben weinig eiwitten hadden hun intracellulaire mensenhandel afgebeeld. De komst van fluorescerend eiwit markeringen, zoals foto-activeerbare-GFP (paGFP) heeft nieuwe instrumenten verschaft om intracellulair verkeer te onderzoeken. Foto-activeerbare-GFP is een vorm van GFP, dat is bijna onzichtbaar na de synthese, maar ontwikkelt zich sterk groen (GFP) fluorescentie na wordt geactiveerd door 413 nm laserlicht en dit signaal is stabiel dagen 25,26. Constructen gebruikt paGFP zijn gebruikt om de intralysosomal handel van het lysosomale eiwit aantonen membraaneiwit 1 (LAMP1) 25, het celoppervlak levering van de Vesiculaire Stomatitis Virus Glycoprotein (VSVG, een marker van de secretieroute) 27 en de omzet van peroxisomen 28 en 29 autofagosomen.
Om het sorteren van APP van de TGN in levende cellen zichtbaar, ontwierpen we plasmide dat de laatste 112 aminozuren van APP gekoppeld met foto-activeerbare (paGFP) op de C-terminal (hierna PAPP-paGFP) 30. Ook hebben we deze experimenten uitgevoerd met volledige lengte APP en vergelijkbare resultaten behaald; de PAPP construct wordt hier gebruikt omdat het helderdere beelden. Vervolgens hebben we foto-activate &# 946; APP-paGFP alleen in de TGN, zoals afgebakend door de TGN marker galactosyltransferase (GalT). Hoewel APP is gemarkeerd met paGFP een snelle axonale transport van APP en klaring visualiseren van de perinucleaire regio, dit is de eerste demonstratie van APP handel van een nauwkeurig omschreven naar het andere 11,31,32. Hier tonen we nauwkeurige foto-activering binnen de TGN en de uitgang van APP in downstream compartimenten en de daaropvolgende splitsing en de klaring van lysosomen 30. De nauwkeurige foto-activatie in de Golgi is breed toepasbaar op andere eiwitten systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze techniek beschrijft de nauwkeurige foto-activatie van membraaneiwitten gelabeld met paGFP in de TGN latere mensenhandel en decolleté te visualiseren. Terwijl paGFP werd gemaakt meer dan tien jaar geleden 25 is dit het eerste voorbeeld van accurate fotoactivering de handel in ontluikende eiwitten volgen downstream compartimenten. Vorige studies met APP-paGFP constructen foto-geactiveerde a peri-nucleaire gebied van de cel, die werd beschouwd als de Golgi 11. Zoals blijkt uit onze microfoto, ly…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
References
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer’s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al. Prediction of ‘aggregation-prone’ and “aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer’s disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer’s disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer’s amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the ‘Swedish’ amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase”;site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
