Abbilden des intrazellulären Transport von APP mit Photoaktivierbare GFP
Summary
Während der Transport von Zelloberflächenproteinen relativ leicht studiert, Visualisieren des Handels mit intrazellulären Proteinen ist viel schwieriger. Hier verwenden wir Konstrukte Einbeziehung photoaktivierbaren GFP und zeigen eine Methode, um genau zu folgen das Amyloid-Vorläuferprotein aus dem Golgi-Apparat, um Downstream-Fächer und folgen Sie den Freiraum.
Abstract
Beta-Amyloid (Aß) ist der Hauptbestandteil von senilen Plaques im Gehirn von Alzheimer-Patienten gefunden. Aß wird aus der sequentiellen Spaltung des Amyloid-Vorläuferprotein (APP), die durch β und γ-Sekretasen abgeleitet. Trotz der Bedeutung von Aß zu AD-Pathologie ist die subzelluläre Lokalisation dieser Spaltungen nicht gut etabliert. Arbeiten in unserem Labor und andere implizieren die endosomale / lysosomale System in APP-Prozessierung nach der Internalisierung von der Zelloberfläche. Allerdings ist die intrazellulären Transport von APP relativ wenig unter.
Während Zelloberflächenproteine sind abänderbar viele Markierungstechniken, es gibt keine einfachen Methoden zum Folgen des Handels mit Membranproteinen vom Golgi. Zu diesem Zweck haben wir APP-Konstrukte, die mit photoaktivierbaren GFP (paGFP) gekennzeichnet wurden, am C-Terminus hergestellt. Nach der Synthese hat paGFP niedrigen Grundfluoreszenz, aber es kann mit 413-nm-Licht t stimuliert werdeno erzeugen eine starke, stabile grüne Fluoreszenz. Mithilfe der Golgi Marker Galactosyltransferase zu Cyan Fluorescent Protein (GalT-GFP) als Ziel verbunden ist, sind wir in der Lage, genau zu photoaktivieren APP in dem Trans-Golgi-Netzwerk. Photo-aktivierte APP-paGFP kann dann verfolgt werden, wie es Verkehre an nachgeschaltete Fächer mit fluoreszenz identifiziert getaggt Fach Markerproteine für die frühe Endosomen (Rab5), den späten Endosomen (Rab9) und Lysosom (LAMP1). Außerdem wurde unter Verwendung Inhibitoren APP Verarbeitung einschließlich Chloroquin oder der γ-Sekretase-Inhibitor-L685, 458, können wir die Pulse-Chase-Experimente durchzuführen, um die Verarbeitung von APP in einzelnen Zellen zu untersuchen.
Wir finden, dass ein großer Anteil von APP schnell bewegt zum Lysosom, ohne an der Zelloberfläche erscheinen, und wird dann aus dem Lysosom durch Sekretase-ähnliche Spaltungen gelöscht. Diese Technik zeigt die Nützlichkeit paGFP zum Folgen des Menschenhandels und die Verarbeitung von intrazellulären Proteinen herm die Golgi an nachgeschaltete Kammern.
Introduction
Das Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) ist die Anwesenheit von senilen Plaques und neurofibrillären Tangles (NFT) im Gehirn. Der Hauptbestandteil der senilen Plaques darstellt β-Amyloid (Aß). Aß wird aus seinem Vorläufer abgeleitet ist; Amyloid-Vorläuferprotein (APP) 1. Das amyloidogene Spaltung von APP beginnt mit der Entfernung von der Ektodomäne von APP durch β-Sekretase-2. Die restlichen 99-Rückstand carboxyterminale Fragment (CTF) durch γ-Sekretase gespalten werden, um Aß 3-7 herzustellen. Während viele Experimente haben die Spaltung der Zelloberflächen-APP nach Internalisierung von der Zelloberfläche in das endosomale / lysosomale System dokumentiert, wurde eine Anzahl von jüngsten Studien vorgeschlagen, den intrazellulären Transport von APP ist auch bei der Regulierung der Verarbeitung 8-11 wichtig.
Es gab eine Reihe von Versuchen bei der Modulation der Niveaus von Aß mit γ-Sekretase-Inhibitoren und Aß immun gewesenotherapies. Allerdings haben neuere klinische Studien mit diesen Therapien zeigten keinen Vorteil, und in einigen Fällen eine Erhöhung der Schaden 12. Ein ungenutztes Strategie Aß Produktion modulieren, um die subzelluläre Lokalisation von APP und γ-Sekretase-Wechselwirkung verändern. Die Golgi, Plasmamembran und Endosomen / Lysosomen wurden alle als mögliche Schauplätze für γ-Spaltung von APP wurde vorgeschlagen. Forschung aus unserem Labor legt nahe, dass APP und die γ-Sekretase ansässig sind Proteine der lysosomalen Membran 13. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die lysosomale γ-Sekretase einen sauren pH-Optimum 13. Zusätzlich Alkalisierung der endosomalen / lysosomalen System mit Chloroquin oder NH 4 Cl, wurde gezeigt, dass die Produktion von A & bgr; 14 zu verringern. y-Sekretase Inhibition oder Knockout oder Presenilin führt zu APP-CTFs Ansammlung im Lysosom 15-17. Darüber hinaus stören APP Endozytose senkt Aß Produktion 18-20.
Trotz der Bedeutung der Golgi als Sortierstation für naszierende Proteine und Proteine aus dem endosomalen / lysosomalen System zurückgeführt wird, hat die den intrazellulären Transport von APP nicht ausführlich 21 untersucht. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass APP kann dem Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) über die Interaktion mit dem Komplex Retromer recycelt werden. Herunterregulierung des Retromer Komplex abnimmt Aß Produktion 8,22-24. Jedoch der Austritt von APP vom Golgi wurde noch nicht ausreichend untersucht.
Beim Folgen der Endozytose von Zelloberflächenproteine, wie Transferrin-Rezeptors sind, leicht markiert und anschließend, nach dem Handel von intrazellulären Proteinen ist schwieriger. In der Tat haben einige Proteine hatten ihre intrazellulären Transport abgebildet. Das Aufkommen von fluoreszierenden Protein-Tags, wie photoaktivierbare-GFP (paGFP), hat neue Tools bereitgestellt, um intrazellulären Transport zu untersuchen. Photoaktivierbare-GFP ist eine Form von GFP, die nach der Synthese nahezu unsichtbar ist, aber entwickelt sich stark grün (GFP) Fluoreszenz, nachdem sie von 413 nm Laserlicht aktiviert, und dieses Signal für die Tage 25,26 stabil ist. Konstrukte mit paGFP wurden verwendet, um die intralysosomalen Handel des lysosomalen Proteins nachweisen membrane protein 1 (LAMP1) 25, die Zelloberfläche Lieferung des vesikulären Stomatitis-Virus-Glykoprotein (VSVG, ein Marker für den sekretorischen Weg) 27, und der Umsatz von Peroxisomen 28 und 29 Autophagosomen.
Um die Sortierung von APP aus dem TGN in lebenden Zellen sichtbar, haben wir Plasmid, die letzten 112 Aminosäuren von APP zu photoaktivierbare (paGFP) auf der C-terminalen 30 verbunden (als & beta; APP-paGFP bezeichnet). Wir haben auch durchgeführt, diese Experimente mit voller Länge APP und erzielte ähnliche Ergebnisse; die & beta; APP-Konstrukt wird hier verwendet, da es ein helleres Bild. Wir haben dann Foto-activate &# 946; APP-paGFP nur in dem TGN, wie durch den TGN Marker Galactosyltransferase (GalT) abgegrenzt. Obwohl APP mit paGFP getaggt worden, um schnellen axonalen Transport von APP und Abstand von der perinukleären Region sichtbar zu machen, ist dies die erste Demonstration von APP Handel von einer sorgfältig definierten Fach zu einem anderen 11,31,32. Hier zeigen wir eine genaue Photoaktivierung im TGN und den Austritt von APP in nachgeschaltete Fächern und anschließende Spaltung und Clearance von Lysosomen 30. Die exakte Photoaktivierung im Golgi ist weit auf anderen Proteinsystemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Technik beschreibt die genaue Photoaktivierung von Membranproteinen mit paGFP getaggt im TGN, um nachfolgende Handel und Spaltung zu visualisieren. Während paGFP wurde vor über einem Jahrzehnt 25 erstellt, ist dies das erste Beispiel für eine genaue Photoaktivierung zur Verhinderung des Handels mit freiwerdenden Proteine an nachgeschaltete Kammern folgen. Frühere Studien mit APP-paGFP Konstrukte photoaktivierten eine peri-Kernbereich der Zelle, die als auf der Golgi 11 sein. Jedoch,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
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