Imágenes del tráfico intracelular de APP con GFP fotoactivable
Summary
Mientras se estudia de forma relativamente fácil el transporte de proteínas de superficie celular, visualizando el tráfico de proteínas intracelulares es mucho más difícil. Aquí, utilizamos construcciones que incorporen buenas prácticas agrarias fotoactivable y demostrar un método para seguir con precisión la proteína precursora de amiloide del aparato de Golgi compartimentos río abajo y siga su aclaramiento.
Abstract
Beta-amiloide (Aß) es el constituyente principal de las placas seniles que se encuentran en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Aß se deriva de la escisión secuencial de Proteína Precursora de Amiloide (APP) por β y gamma-secretasas. A pesar de la importancia de Aß a la patología AD, la localización subcelular de estas divisiones no está bien establecida. El trabajo en nuestro laboratorio y otros implican el sistema endosomal / lisosomal en el procesamiento de APP después de la internalización de la superficie celular. Sin embargo, el tráfico intracelular de APP es relativamente poco estudiada.
Mientras que las proteínas de la superficie celular son modificables a muchas técnicas de etiquetado, no hay métodos simples para seguir el tráfico de proteínas de la membrana del Golgi. Para ello, hemos creado construcciones APP que fueron etiquetadas fotoactivable GFP (paGFP) en el C-terminal. Después de la síntesis, paGFP tiene baja fluorescencia basal, pero puede ser estimulado con 413 nm luz to producir una fluorescencia de color verde fuerte y estable. Al utilizar el aparato de Golgi marcador galactosiltransferasa acoplado a cian proteína fluorescente (GalT-PPC) como un objetivo, estamos en condiciones de precisión fotoactivar APP en la red trans-Golgi. Activada por fotos APP-paGFP puede entonces ser seguido, ya que trafica a los compartimentos posteriores identificados con fluorescencia etiquetados proteínas marcadoras de compartimentos para el endosoma temprano (Rab5), a finales del endosoma (Rab9) y el lisosoma (LAMP1). Por otra parte, el uso de inhibidores de procesamiento de APP incluyendo cloroquina o el inhibidor de la γ-secretasa L685, 458, estamos en condiciones de realizar experimentos de pulso-caza para examinar el procesamiento de APP en las células individuales.
Nos encontramos con que una gran parte de APP se mueve rápidamente hacia el lisosoma sin aparecer en la superficie celular, y luego se elimina del lisosoma por divisiones-secretasa similares. Esta técnica demuestra la utilidad de paGFP para seguir el tráfico y el procesamiento de las proteínas intracelulares from el Golgi a los compartimentos aguas abajo.
Introduction
El sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer (AD) es la presencia de placas seniles y ovillos neurofibrilares (NFTs) en el cerebro. El principal componente de las placas seniles es β-amiloide (Aß). Aß se deriva de su precursor; proteína precursora amiloide (APP) 1. La escisión de APP amiloidogénico comienza con la eliminación del ectodominio de APP por la β-secretasa 2. El fragmento carboxilo terminal 99-residuo restante (CTF) puede ser escindido por γ-secretasa para producir Aß 3-7. Mientras que muchos experimentos han documentado la escisión de APP de la superficie celular después de la internalización de la superficie celular en el sistema endosomal / lisosomal, un número de estudios recientes han sugerido que el tráfico intracelular de APP también es importante en la regulación de su procesamiento 8 a 11.
Ha habido un número de intentos en la modulación de los niveles de Aß con inhibidores de la gamma secretasa y-Aß Immunotherapies. Sin embargo, los ensayos clínicos recientes con estas terapias no mostraron ningún beneficio, y, en algunos casos, causó daños 12. Una estrategia sin explotar para modular la producción de Aß es alterar la localización subcelular de la APP y la interacción-γ-secretasa. El aparato de Golgi, membrana plasmática, y los endosomas / lisosomas han sido sugeridos como posibles localizaciones para γ-escisión de APP. La investigación de nuestro laboratorio sugiere que la APP y la γ-secretasa son proteínas residentes de la membrana lisosomal 13. Además, hemos encontrado que la γ-secretasa lisosomales tiene un pH óptimo ácido 13. Además, la alcalinización del sistema endosomal / lisosomal con cloroquina o NH 4 Cl, se ha demostrado que disminuye la producción de Aß 14. gamma-secretasa inhibición o nocaut o presenilina conduce a la acumulación de APP-FASC en el lisosoma 15-17. Por otra parte, la interrupción de APP endocitosis disminuye la producción de Aß de 18-20.
A pesar de la importancia del Golgi como una estación de clasificación para las proteínas y las proteínas reciclados desde el sistema endosomal / lisosomal nacientes, el tráfico intracelular de APP no se ha estudiado en detalle 21. Trabajos recientes han demostrado que la APP puede ser reciclado a la red trans-Golgi (TGN) a través de la interacción con el complejo retromer. Regulación a la baja del complejo retromer disminuye la producción de Aß 8,22-24. Sin embargo, la salida de APP desde el Golgi no ha sido bien estudiado.
Mientras que después de la endocitosis de las proteínas de la superficie celular, tales como el receptor de transferrina, son fácilmente etiquetados y seguido, tras el tráfico de proteínas intracelulares es más difícil. De hecho, pocas proteínas han tenido su tráfico intracelular fotografiada. El advenimiento de las etiquetas de proteínas fluorescentes, tales como foto-activable-GFP (paGFP), ha proporcionado nuevas herramientas para examinar el tráfico intracelular. Photo-activable-GFP es una forma de GFP que es casi invisible después de la síntesis, pero desarrolla verde fuerte (GFP) de fluorescencia después de ser activado por luz láser 413 nm y esta señal es estable por día 25,26. Las construcciones utilizando paGFP se han utilizado para demostrar el tráfico intralisosomal de la proteína lisosómica proteína de membrana 1 (LAMP1) 25, la entrega de la superficie celular del virus de estomatitis vesicular glicoproteína (VSVG, un marcador de la ruta secretora) 27, y el volumen de los peroxisomas 28 y 29 autofagosomas.
Con el fin de visualizar la clasificación de APP desde el TGN en células vivas, hemos diseñado plásmido que expresa los últimos 112 aminoácidos de APP acoplados a la foto-activable (paGFP) en el C-terminal (referido como βAPP-paGFP) 30. También hemos realizado estos experimentos con APP de longitud completa y ha logrado resultados similares; el constructo ΒAPP se utiliza aquí, ya que proporciona imágenes más brillantes. A continuación, la foto-activación y# 946; APP-paGFP sólo en el TGN, como demarcada por el TGN marcador galactosiltransferasa (GalT). Aunque APP ha sido etiquetado con paGFP para visualizar el transporte axonal rápido de la APP y el aclaramiento de la región perinuclear, esta es la primera demostración de tráfico de APP de un compartimento a otro cuidadosamente definido 11,31,32. Aquí, demostramos exacta foto-activación dentro del TGN y la salida de APP en compartimentos de bajada y posterior escisión y el visto bueno de los lisosomas 30. La foto-activación precisa dentro del Golgi es ampliamente aplicable a otros sistemas de proteínas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica se describe la precisión de foto-activación de las proteínas de membrana etiquetados con paGFP en el TGN para visualizar su posterior tráfico y escote. Mientras paGFP fue creado hace una década 25, este es el primer ejemplo de la foto-activación precisa para seguir el tráfico de proteínas nacientes en los diferentes compartimentos aguas abajo. Estudios anteriores utilizando APP-paGFP construye foto activada una región peri-nuclear de la célula, que fue considerado como el Golgi 11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
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