光活性化GFPでAPPの細胞内輸送をイメージング
Summary
細胞表面タンパク質の輸送を比較的容易に研究されているが、細胞内タンパク質の輸送を可視化することははるかに困難です。ここでは、光活性化GFPを組み込んだコンストラクトを使用して、正確にダウンストリームの区画にゴルジ体からのアミロイド前駆体タンパク質に従い、その隙間に従うようにする方法を実証します。
Abstract
β-アミロイド（Aβ）は、アルツハイマー病患者の脳に見られる老人斑の主要構成成分です。 Aβは、βおよびγセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（APP）の連続的切断に由来します。 AD病理へのAβの重要性にもかかわらず、これらの切断の細胞内局在は、十分に確立されていません。我々の研究室での作業などが細胞表面から内部移行した後のAPP処理にエンドソーム/リソソーム系を巻き込みます。しかし、APPの細胞内輸送は比較的understudiedです。
細胞表面タンパク質は、多くの標識技術に修正可能であるが、ゴルジ体からの膜タンパク質の輸送を以下のための単純な方法は存在しません。この目的のために、我々はC末端に光活性化GFP（paGFP）でタグ付けされたAPPコンストラクトを作成しました。合成後、paGFPは低い基底蛍光を有するが、413 nmの光Tで刺激することができO強く、安定した緑色の蛍光を生じます。ターゲットとしてシアン蛍光タンパク質（GalTの-CFP）に結合されたゴルジマーカーガラクトシルトランスフェラーゼを使用することにより、我々はトランスゴルジネットワーク内の正確光活性化するAPPすることができます。それは蛍光で識別下流区画にトラフィック早期エンドソーム（Rab5の）、後期エンドソーム（Rab9）およびリソソーム（LAMP1）のためのコンパートメントマーカータンパク質をタグ付けとして光活性化APP-paGFPは、その後に続くことができます。さらに、クロロキンまたはγセクレターゼ阻害剤L685、458を含むAPP処理に阻害剤を使用して、我々は、単一の細胞内でAPPのプロセシングを調べるために、パルスチェイス実験を実行することができます。
我々は、APPの大部分は、細胞表面に現れることなく、リソソームに迅速に移動し、その後セクレターゼ様の切断によってリソソームから除去されることがわかります。この技術はあちこち細胞内タンパク質の輸送と処理を以下のためpaGFPの有用性を実証下流の区画にゴルジ体をメートル。
Introduction
アルツハイマー病（AD）の特徴は、脳における老人斑および神経原線維変化（NFT）の存在です。老人斑の主要構成成分はβアミロイド（Aβ）です。 Aβは、その前駆体から誘導されます。アミロイド前駆体タンパク質（APP）1。 APPのアミロイド形成性切断がβセクレターゼ2によるAPPの細胞外ドメインの除去から始まります。残りの99残基のカルボキシル末端フラグメント（CTF）は、Aβ3-7を生成するために γセクレターゼによって切断され得ます。多くの実験は、細胞表面からエンドソーム/リソソーム系に内在化した後、細胞表面APPの切断を記録しているが、最近の多くの研究は、APPの細胞内輸送は、その処理8-11の調節においても重要であることを示唆しています。
γセクレターゼ阻害剤とのAβIMMUNとAβのレベルを調節で多くの試みがなされていますotherapies。しかしながら、これらの治療法との最近の臨床試験は全く効果を示さなかった、そして、いくつかのケースでは、12害を引き起こしました 。 Aβ産生を調節する未開発の戦略は、APPの細胞内局在およびγセクレターゼの相互作用を変化させることです。ゴルジ、形質膜、およびエンドソーム/リソソームは、すべてのAPPのγ切断の可能なロケールとして提案されています。我々の研究室からの研究は、APPおよびγセクレターゼは、リソソーム膜13の常駐タンパク質であることを示唆しています。さらに、我々は、リソソームγセクレターゼは、酸性至適pH 13を有していることを見出しました。さらに、クロロキンまたはNH 4 Clでエンドソーム/リソソーム系のアルカリ、Aβ14の産生を減少させることが示されています。 γセクレターゼ阻害またはノックアウトまたはプレセニリンは、リソソーム15-17におけるAPP-CTFSの蓄積につながります。また、APPのエンドサイトーシスを中断すると、Aβ産生18-20を低下させます。
エンドソーム/リソソーム系からリサイクル新生タンパク質およびタンパク質のための仕分け局としてゴルジ体の重要性にもかかわらず、APPの細胞内輸送を詳細21で検討されていません。最近の研究は、APPはレトロマー複合体との相互作用を介してトランスゴルジネットワーク（TGN）に再循環させることができることを示しています。レトロマー複合体のダウンレギュレーションは、Aβ産生8,22-24を減少させます。しかし、ゴルジ体からのAPPの出力は十分に研究されていません。
そのようなトランスフェリン受容体などの細胞表面タンパク質のエンドサイトーシスに追従して、容易に標識され、続いており、細胞内タンパク質の輸送以下がより困難です。実際には、いくつかのタンパク質は、それらの細胞内輸送が撮像ありました。このような光活性化-GFP（paGFP）などの蛍光タンパク質タグの出現は、細胞内輸送を調べるために新しいツールを提供してきました。光活性化-GFPは、GFの一形態であります合成後、ほとんど目に見えないですが、413 nmのレーザー光によって活性化された後、強い緑色（GFP）の蛍光を開発し、この信号は日25,26のために安定している、P。 paGFPを用いた構築物は、リソソームタンパク質のリソソーム内輸送を実証するために使用されている膜タンパク質1（LAMP1）25、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSVG、分泌経路のマーカー）27の細胞表面の配信、及びペルオキシソームの代謝回転28とオートファゴソーム29。
生細胞にTGNからのAPPのソートを可視化するために、我々は、C末端（βAPP-paGFPという）30上の光活性化（paGFP）に結合されたAPPの最後の112アミノ酸を発現するプラスミドを設計しました。我々はまた、完全長のAPPでこれらの実験を行い、同様の結果を達成しています。それは明るい画像を提供するため、βAPP構築物は、ここで使用されています。我々その後、フォトアクティブ＆＃946;のみTGNにおけるAPP-paGFP、TGNマーカーガラクトシルトランスフェラーゼ（GalTの）によって区画として。 APPは核周辺領域からAPPおよびクリアランスの迅速な軸索 輸送を視覚化するためにpaGFPでタグ付けされているが、これは別の11,31,32に1慎重に定義された区画からのAPP人身売買の最初の実証です。ここでは、正確なTGN内の光活性化と下流の区画およびリソソーム30からの後続の切断や隙間にAPPの出力を示しています。ゴルジ内で正確な光活性化は、他のタンパク質系に広く適用可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
この技術は、その後の人身売買と切断を可視化するために、TGNにpaGFPでタグ付けされた膜タンパク質の正確な光活性化について説明します。 paGFPは25十年以上前に作成されたが、これは下流のコンパートメントに新生タンパク質の輸送を追跡する正確な光活性化の最初の例です。 APP-paGFPを使用した以前の研究では、光活性化ゴルジ体11であると考えられた細胞の核周囲の領域?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
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