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Bioengineering

एक तीन औषधि कार्तीय प्रिंटर का उपयोग कर Bioprinted सेलुलर निर्माणों की व्यवहार्यता

Published: September 22, 2015 doi: 10.3791/53156
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 3, 1, 3, 1
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina, 3Department of Bioengineering, Clemson University

Introduction

ऊतक इंजीनियरिंग, बनाए रखने के लिए बहाल करने, या देशी ऊतक को बढ़ाने के लिए और कार्यात्मक के विकल्प के विकास में जीव विज्ञान और इंजीनियरिंग के सिद्धांतों का उपयोग करता है। ऊतक इंजीनियरिंग में और साथ ही सेल आधारित सेंसर, दवा / विषाक्तता स्क्रीनिंग, ऊतक या ट्यूमर मॉडल, और दूसरे में वैज्ञानिक और तकनीकी विकास की सुविधा होगी मांग पर तीन आयामी biomimetic निर्माणों पैदा करने की क्षमता है। यह बारीकी से कोशिकाओं और देशी ऊतक में बाह्य मैट्रिक्स की अत्यधिक आयोजित बातचीत की नकल करना होगा क्योंकि ऊतक इंजीनियर निर्माणों के तीन आयामी संगठन निर्माण विधि का एक बुनियादी घटक है।

Biodegradable और आकार के गठन के लिए तीन आयामी मचानों कोशिकाओं कोशिकाओं के एक दो आयामी परत के रूप में विस्थापित क्योंकि उपन्यास ऊतक निर्माणों को पैदा करने में महत्वपूर्ण कारक हैं, लेकिन इष्ट तीन आयामी में विकसित करने की क्षमता की कमी है। पाड़ सेल के लिए एक अस्थायी आधार के रूप में कार्य करता हैलगाव और प्रसार, इसलिए इसे चलाया हुआ porosity और biodegradability, और पर्याप्त यांत्रिक Integrit साथ सामग्री से निर्माण किया जाना चाहिए। पाड़ सामग्री साइटोटोक्सिक है या मेजबान से एक प्रतिकूल प्रतिक्रिया नहीं बनाना चाहिए। हाइड्रोजेल सामान्यतः ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक में इस्तेमाल किया गया है, और कारण उनके hydrophilicity करने के लिए, हाइड्रोजेल स्ट्रक्चरल भर द्रव और गैस विनिमय की अनुमति है। अलग हाइड्रोजेल के संयोजन से, संश्लेषित हाइड्रोजेल के गुण अलग आवेदन की आवश्यकता को पूरा करने के लिए परिवर्तनीय हैं।

पारंपरिक ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण कोशिकाओं के बाद FABRICATIO के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं कि अकोशिकीय झरझरा बलि मचानों का निर्माण शामिल है। कई तकनीकों जैसे फाइबर संबंध, विलायक कास्टिंग के रूप में कार्यरत है, और मोल्डिंग पिघल, लेकिन ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए न्यूनतम सफल साबित कर दिया है। फाइबर संबंध तरीकों फाइबर विशिष्ट आकार में गठबंधन करने की अनुमति है, लेकिन वे समर्थक के ही सक्षम हैंबहुत पतली पाड़ ducing। विलायक कास्टिंग तरीकों, अत्यधिक झरझरा निर्माणों का उत्पादन हालांकि सबसे बड़ा उत्पादन झिल्ली thic केवल 3 एमएम था। इसलिए, तीन आयामी निर्माणों बनाने के लिए इन तकनीकों का उपयोग संभव नहीं है। पिघल मोल्डिंग तकनीक तीन आयामी मचानों का निर्माण करने में सफल साबित हुई, लेकिन इस तरह के उच्च तापमान के जैविक सामग्री के उत्पादन की प्रक्रिया के दौरान शामिल नहीं किया जा सकता है कि आवश्यक हैं। Scaffolds-पूर्व परिभाषित या चलाया हुआ microstructures और साथ तीन आयामी मचानों का उत्पादन करने के लिए ऊतक इंजीनियरिंग की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अपनी क्षमता में सीमित कर रहे हैं के बाद निर्माण वरीयता प्राप्त। ठोस पाड़ बोने प्रौद्योगिकियों के साथ एक अन्य प्रमुख मुद्दा vascularization और गरीब यांत्रिक की कमी है।

Bioprinting के बाद से पारंपरिक के नुकसान से उबरने के लिए nontoxic, biodegradable, थर्मामीटरों प्रतिवर्ती जैल के उपयोग के माध्यम से तीन आयामों को बढ़ा दिया गया है। ठोस freeform निर्माण टी के कुछवर्तमान में नियोजित किया जा रहा echniques लेजर की सहायता bioprinting और inkjet मुद्रण कर रहे हैं। लेजर की मदद से bioprinting तकनीक एक स्पंदित लेजर स्रोत, एक लक्ष्य थाली, और तीन आयामी उत्पन्न करने के लिए एक प्राप्त सब्सट्रेट का उपयोग करें। हालांकि, इस तकनीक की वजह से कम throughput, कम सेल व्यवहार्यता तक सीमित है, और केवल photocrosslinkable prepolymers एक Crosslinked हाइड्रोजेल फार्म का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि केवल गढ़े संरचनाओं की सीमित व्यवस्था का उत्पादन कर सकते हैं। Inkjet मुद्रण picoliter स्याही जमा करके एक सब्सट्रेट पर डिजिटल छवि डेटा reproduces कि एक गैर संपर्क पद्धति के रूप में विकसित किया गया था। हालांकि, एक उच्च संकल्प निर्माण का उत्पादन नहीं करता inkjet मुद्रण, अनुभव तेजी से प्रोटीन विकृतीकरण निर्माण करता है, और कोशिकाओं के कई बयान के दौरान lysed रहे हैं।

वर्तमान में, नए additive विनिर्माण bioprinting तरीके विकसित किए गए हैं। इन प्रणालियों में कोशिकाओं, प्रोटीन, वृद्धि कारक है, और biomimetic हाइड्रोजेल आम तौर पर मैट्रिक्स मेटर में एकीकृत कर रहे हैंials निर्माण की प्रक्रिया के दौरान और समवर्ती बारीकी से देशी की माइक्रोआर्किटेक्चर है कि नकल के तीन आयामी पाड़ आधारित सेल से लदी निर्माणों उत्पन्न करने के लिए कंप्यूटर नियंत्रित actuators का उपयोग कर जमा किया। सेल से लदी हाइड्रोजेल अनेक प्रकार की कोशिकाओं, या सजातीय से मिलकर, विषम हो सकता है जो bioink, बनाते हैं। Additive विनिर्माण प्रणालियों जमा bioink ड्रॉप द्वारा ड्रॉप एक्स, वाई, जेड और दिशाओं में हिल में सक्षम एक कंप्यूटर नियंत्रित मंच पर या परत-दर-परत डिस्पोजेबल सीरिंज और सुझावों के माध्यम से। कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के माध्यम से, मुद्रित मचानों की वास्तुकला आसानी से आवेदन की आवश्यकताओं के आधार पर चालाकी से किया जा सकता है। परम्परागत तकनीकों के विपरीत, तीन आयामी चिकित्सा प्रौद्योगिकियों (चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, कंप्यूटर टोमोग्राफी) रोगी विशेष निर्माण पैदा करने, डिजाइन में शामिल किया जा सकता है। निर्माणों एक उच्च एल के साथ उत्पादन कर रहे हैं, क्योंकि इन तरीकों में भी vascularized प्रतिस्थापन के उत्पादन की संभावना की अनुमतिOcal सेल घनत्व, सेल सेल बातचीत की इजाजत दी और बाद आरोपण surviva की संभावना में सुधार।

पल्मेट्टो प्रिंटर तीन आयामी विषम ऊतक निर्माणों (चित्रा 1) उत्पन्न करने के लिए प्रोग्राम रोबोट निर्माण के तरीकों का उपयोग करता है कि एक कस्टम निर्मित तीन आयामी बहु-औषधि प्रणाली है। यह अनूठा संयोजन में माल की अधिकता का उपयोग विषम संरचनाओं का निर्माण करने के लिए अनुमति देता है। bioprinter के प्रारंभ में यह तुम bioprinted निर्माणों की printability अनुकूलन करने के लिए मानकों की एक किस्म स्थापित करने के लिए अनुमति देता है क्योंकि bioprinting में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक है।

bioprinter उपयोगकर्ता एक इंटरैक्टिव टच स्क्रीन नियंत्रण कक्ष के माध्यम से चल रही है जो एक प्रोग्राम तर्क नियंत्रक (PLC), (चित्रा 1, ए) के द्वारा नियंत्रित स्टार्टअप, संचालन और शटडाउन दृश्यों के साथ एक बैच प्रकार की प्रक्रिया शामिल है। जैव के प्रदूषण को रोकने के लिएतार्किक सामग्री bioprinter एक सकारात्मक दबाव पाली (मिथाइल methacrylate) में संलग्न है एक उच्च दक्षता कण arrestance (HEPA) के साथ (PMMA) चैम्बर हवा परिसंचरण तंत्र -filtered (चित्रा 1, बी, सी)। प्रिंटर के इंटीरियर में निर्मित पराबैंगनी प्रकाश स्रोतों (चित्रा 1, डी) का उपयोग निष्फल किया जा सकता है। bioprinter का केंद्रीय घटक reproducibly 10 माइक्रोमीटर (चित्रा 1, ई) की शुद्धता के साथ एक मशीन टिप जगह कर सकते हैं कि एक पूरी तरह से प्रोग्राम स्थिति रोबोट है। एक रोटरी पेंच का उपयोग कर 230 NL (चित्रा 1, एफ) के रूप में के रूप में छोटे संस्करणों जमा करने में सक्षम हैं जो तीन डिस्पेंसर, कर रहे हैं। वे एक मशीन के लिए (चित्रा 1, जी) मुद्रण मानकों को नियंत्रित करने वाले अलग-अलग कंप्यूटर का उपयोग कर स्वतंत्र रूप से प्रोग्राम कर रहे हैं। रोटरी स्क्रू वितरण एक सिरिंज नीचे और सिरिंज टिप से बाहर bioink स्थानांतरित करने के लिए एक मोटर चालित पेंच के रोटेशन का इस्तेमाल करता है। इन dispensers एक pneumatical पर बढ़ रहे हैंLy नियंत्रित उपकरण नेस्ट (2A चित्रा, बी), रोबोट क्रमादेशित नियंत्रण (चित्रा 1, एच) के तहत जेड अक्ष रोबोट भुजा पर मुहिम शुरू की मशीन स्विच करने की अनुमति देता है।

XYZ रोबोट (चित्रा 1, मैं) एक कंप्यूटर चल डिजाइन सॉफ्टवेयर से मुद्रण निर्देश प्राप्त करता है। प्रत्येक कार्यक्रम के वितरण के स्थानों, अंशांकन दिनचर्या, और औषधि बदलते प्रोटोकॉल होता है। प्रत्येक औषधि सामग्री जमा करेंगे, जहां मुख्य रूप से xyz के होते उत्पन्न निर्माणों के डिजाइन समन्वय करता है। bioprinter XYZ सिरिंज टिप अंत का समन्वय करता है कि निर्धारित दो ऑप्टिकल प्रकाश सेंसर (चित्रा -2) शामिल हैं। इन सेंसरों की मशीन टिप सिरों के पदों की गणना करने के लिए इन का उपयोग करता है रोबोट है, जो करने के लिए जानकारी का समन्वय भेजें। एक ACCURA के साथ दूरी को मापने के लिए 30 x 100 माइक्रोमीटर स्थान आकार की 633 एनएम डायोड लाल लेजर बीम कि परियोजनाओं के लिए एक अतिरिक्त विस्थापन लेजर (चित्रा 2 डी) है0.1 माइक्रोमीटर की सीवाई। किरण अत्यधिक ध्यान केंद्रित किया है जब रोबोट मुद्रण सतह के Z दूरी तय करता है। यह माप, और Z में टिप अंत की ऑप्टिकल प्रकाश सेंसर माप, सटीक जेड की गणना मुद्रण सतह के संबंध में औषधि टिप जगह के लिए इस्तेमाल किया निर्देशांक अनुमति देता है। औषधि सुझावों के वाई और जेड केन्द्रों लगाने के लिए एक्स-अक्ष उन्मुख ऑप्टिकल प्रकाश संवेदक में डालता और खड़ी ले जाते हैं, और पार्श्व एक शाफ़्ट सेंसर के माध्यम से एक्स-धुरी के केंद्र खोजने के लिए। सतह वितरण टिप अंत की स्थिति के सापेक्ष है जहां निर्धारित करने के लिए + CZ = d से कुल्हाड़ी +: मुद्रण सतह xyz अंतरिक्ष में एक फ्लैट विमान के लिए सूत्र का उपयोग मैप किया गया है। प्रिंटर चरण (चित्रा 1, जे) व्यास में 80 मिमी के लिए एक नमूना पेट्री डिश ऊपर रखती है और सेट तापमान (चित्रा 1, कश्मीर) बनाए रखने के लिए एक recirculating पानी के स्नान का उपयोग करता है। स्टेज तापमान -20 की एक सीमा के भीतर स्थापित किया है और भीतर स्थिर बनी हुई जा सकता है। एक यूएसबी कैमरा है घुड़सवाररोबोट जेड हाथ पर मुद्रण प्रक्रिया (चित्रा 1, एल) के दौरान वितरण टिप के एक बढ़ाया देखने प्रदान करने के लिए। मुद्रण प्रक्रिया (चित्रा 1, एल) के दौरान bioprinter का एक पूरा दृश्य प्रदान करता है कि चैम्बर इंटीरियर के ऊपर की ओर घुड़सवार एक दूसरे कैमरा है।

एक कंप्यूटर एडेड डिजाइन ड्राइंग सॉफ्टवेयर बयान पैटर्न निर्धारित करता है और उपयोगकर्ता संवर्द्धित स्थान दिया बूंदों और जटिल संरचनाओं (चित्रा 3) उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है। तीन आयामी रास्ते मैन्युअल प्रिंटर-संगत डिजाइन सॉफ्टवेयर में कोडित या एक अलग कंप्यूटर एडेड डिजाइन ड्राइंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 4, 1 टेबल) से आयात किया जा सकता है। प्रिंटर-संगत सॉफ्टवेयर की अनुमति देता है ऐसे सिरिंज टिप अंत और subst के बीच बयान विधि (एकल छोटी बूंद बयान या सतत मार्ग जमाव) रास्ते में से तीन आयामी ज्यामिति, जमा दर, दूरी के रूप में मुद्रण के मापदंडों के रूपांतरोंदर मुद्रण सतह, एक व्यक्ति ड्रॉप, और ऊंचाई जमा और सिरिंज लाने के लिए समय की राशि बूंदों के बयान के बीच उठाया है। प्रत्येक कार्यक्रम मुद्रण के दौरान, ऑपरेटर के हस्तक्षेप के बिना, एक बाँझ वातावरण प्रदान करने के लिए xyz के वितरण के स्थानों, टिप अंशांकन दिनचर्या, और औषधि बदलते प्रोटोकॉल होता है। रोबोट का प्रोग्राम तर्क नियंत्रक (PLC) डिजाइन सॉफ्टवेयर चल रहे कंप्यूटर से निर्देश प्राप्त करता है और बाहरी नियंत्रकों से घटनाओं के समय (उदाहरण के लिए, डिस्पेंसर) नियंत्रित करता है। ऐसा करने के लिए, पीएलसी डिस्पेंसर नियंत्रित करने के लिए एक पाशन तंत्र का उपयोग करता है रोबोट पोजीशनिंग डिवाइस, और पर्यावरणीय कारकों।

एक रोटरी-पेंच, तरल-वितरण प्रणाली का उपयोग तीन आयामी प्रत्यक्ष लिखने bioprinting अधिक कुशल, सटीक, और पिछले विधियों की तुलना में आसान होने की कोशिकाओं को जमा करने की प्रक्रिया की अनुमति देता है। इस अध्ययन कस्टम बनाया bioprinter सीई पैदा करने में सक्षम है पता चलता हैउच्च सेल व्यवहार्यता के साथ करूँगा से लदी हाइड्रोजेल निर्माणों।

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Protocol

Alginate hydrogels के तीन आयामी Bioprinting के लिए जिलेटिन युक्त पदार्थ की 1. तैयारी

  1. उच्च सामग्री के साथ जुड़े कम व्यवहार्यता से बचने के लिए Pataky एट अल 11 से वर्णित कैल्शियम / जिलेटिन सब्सट्रेट विधि निम्नलिखित कैल्शियम / जिलेटिन सब्सट्रेट तैयार करें। कैल्शियम / जिलेटिन सब्सट्रेट विधि नीचे सूचीबद्ध है।
    1. आसुत जल में कैल्शियम क्लोराइड निर्जलीकरण (1.5% wt), सोडियम क्लोराइड (0.9% WT), और सुअर जिलेटिन (2% WT) का मिश्रण है और एक 100 मिमी जिलेटिन समाधान बनाने के लिए 2 मिनट के लिए उबाल लें।
  2. जेल हे करने के लिए फ्रिज में एक सपाट सतह पर, 100 मिमी मानक पेट्री डिश में जिलेटिन / कैल्शियम समाधान के 5 मिलीलीटर डालो एक भी सतह पर कोटिंग बनाने के लिए चारों ओर समाधान चक्कर आने, और जगह / एन (जेल के लिए अनुमति देने में कम से कम 8 उपयोग करने से पहले मानव संसाधन)।
  3. जिलेटिन / 2 CaCl समाधान के लिए टाइटेनियम डाइऑक्साइड (0.3% WT) जोड़ने के लिए, सब्सट्रेट सतह की अस्पष्टता को बढ़ाने के लिए। 10 मिनट के लिए हलचल। Autयह बाँझ 30 मिनट के लिए तरल पदार्थ चक्र पर जिलेटिन / 2 Tio समाधान oclave।
    1. पहले से तैयार जिलेटिन प्लेटों की सतह के लिए जिलेटिन / 2 Tio समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें। यह समान रूप से सतह भर में फैला हुआ है सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण भंवर। 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज हे में जेल की अनुमति दें / एन (उपयोग करने से पहले कम से कम 8 घंटे जेल लिए अनुमति देते हैं)। substrates के 3 दिन के भीतर किया जाना चाहिए।

2. Alginate ऑक्सीकरण

  1. नीचे वर्णित Bouhadir एट अल 30 से आंशिक रूप से ऑक्सीकरण alginate के लिए विधि निम्नलिखित सोडियम alginate bioink oxidize।
    1. एक 5% ऑक्सीकरण alginate समाधान बनाने के लिए, आसुत पानी की 100 मिलीलीटर में सोडियम alginate की 1 ग्राम भंग। एक 5% ऑक्सीकरण समाधान का उत्पादन करने के लिए, सोडियम periodate का एक जलीय समाधान (0.25 एम, 0.25 mmol), ऑक्सीकरण एजेंट जोड़ें। आरटी पर 19 घंटे के लिए हलचल। इसकी वजह समाप्त करने के लिए 24 घंटे के बाद समाधान के लिए 40 मिलीलीटर इथाइलीन ग्लाइकॉल जोड़ेंction।
    2. समाधान में सोडियम क्लोराइड की 2.5 ग्राम भंग। ऑक्सीकरण alginates वेग के लिए: (1 अनुपात 2) एथिल शराब की एक अतिरिक्त राशि जोड़ें। अवक्षेप इकट्ठा करने के लिए 1,000 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र और आसुत जल में उन्हें फिर से भंग। इथेनॉल धोने दोहराएँ।
    3. रुक सूखे के उपयोग के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर ऑक्सीकरण alginate छर्रों और दुकान।
  2. सोडियम का प्रतिशत को मापने के द्वारा ऑक्सीकरण की डिग्री का निर्धारण इथाइलीन ग्लाइकॉल से समाप्त किया जा रहा से पहले भस्म periodate।
    1. एक पोटेशियम आयोडाइड समाधान (वी / डब्ल्यू 20%, पीएच 7.0 सोडियम फॉस्फेट बफर) और एक thyodene समाधान (वी / डब्ल्यू 10%, पीएच 7.0 सोडियम फॉस्फेट बफर) तैयार करें। आरटी पर ऑक्सीकरण alginate के साथ दो समाधान मिलाएं।
    2. धीरे-धीरे पोटेशियम आयोडाइड और theodyne समाधान के मिश्रण में प्रतिक्रिया व्यक्त की alginate और सोडियम periodate समाधान ड्रॉप। Spectrophotometrically 426 एनएम पर मिश्रण के absorbance के उपाय। यह पहुँच गया है जब एकअधिकतम, वी के रूप में 1 alginate और सोडियम periodate समाधान के इस्तेमाल की मात्रा रिकॉर्ड है।
    3. प्रतिक्रिया है 1 समीकरण । unreacted सोडियम periodate की राशि है समीकरण 1.5
    4. सोडियम की मात्रा periodate भस्म निर्धारण के लिए मूल एकाग्रता से unreacted सोडियम periodate की मात्रा घटाना। पिछले सूत्र का उपयोग करना, alginate की अंतिम ऑक्सीकरण डिग्री का निर्धारण।

3. Alginate पेप्टाइड संयुग्मन

  1. सेल लगाव और प्रसार को बढ़ावा देने के लिए नीचे वर्णित रोली एट अल 31 से RGD-Alginate विकार विधि का पालन करते हुए पहले से तैयार ऑक्सीकरण alginate में एक उजागर arginine ग्लाइसिन-aspartate अनुक्रम (पेप्टाइड) के साथ संयुग्मी ligands।
  2. जलीय carbod प्रयोग करेंजी 4 RGDSPto संयुग्म 31 के साथ iimide रसायन शास्त्र।
  3. एक 0.1 एम 2 (एन morpholino) ethanesulfonic एसिड में 5% ऑक्सीकरण alginate की 1 ग्राम भंग (एमईएस) बफर (पीएच = 4. 1-ethyl- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (ईडीसी, 0.54 mmol) जोड़ें और एन hydroxysuccinimide 2 में एन एच एस, 0.27 mmol): 1 के अनुपात एमाइड मध्यवर्ती के रूप में।
  4. टर्मिनल एमाइन के माध्यम से alginate बहुलक की रीढ़ की हड्डी को 0.28 mmol पेप्टाइड, युग्मन जोड़ें। आर टी ओ / एन पर हलचल।
  5. समाधान के लिए 2.5 ग्राम सोडियम क्लोराइड जोड़कर युग्मन प्रतिक्रिया बंद करो। ऑक्सीकरण alginates वेग के लिए: (1 अनुपात 2) एथिल शराब की एक अतिरिक्त राशि जोड़ें। अवक्षेप इकट्ठा करने के लिए 5 मिनट के लिए 4,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र। सेल संस्कृति हुड में मीडिया Aspirate और आसुत जल में अवक्षेप फिर से भंग। इथेनॉल धोने दोहराएँ।
  6. यह पूरी तरह से सूख जाता है जब तक (एक सफेद पाउडर पदार्थ के रूप में दिखाई देगा) अवक्षेप सूखी-रुक और बाद के लिए सी फ्रिज ° -20 की दुकानका उपयोग करें।

4. मानव वसा ऊतकों stromal कोशिकाओं (hADSC के) सेल संस्कृति

  1. संस्कृति मानव वसा ऊतकों stromal कोशिकाओं (hADSC के) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% glutamine, और 1% antimycin के साथ 15 मिलीलीटर कम ग्लूकोज DMEM के साथ कवर सेल संस्कृति बोतल (T75 बोतल) का इलाज 75 सेमी, में। वे confluency (80-90%) पर पहुंच गया है, जब तक हर दो दिन, सेल संस्कृति हुड में, मीडिया बदलें।
  2. मिला हुआ है एक बार, सेल संस्कृति हुड के लिए T75 बोतल हस्तांतरण और hADSC के ट्रिप्सिन एंजाइम पाचन पद्धति का उपयोग करके रोक देते हैं।
    1. हुड में, कोशिकाओं के बंद सेल संस्कृति मीडिया के सभी महाप्राण। कैल्शियम और मैग्नीशियम (DPBS ++) के साथ है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा के 5 मिलीलीटर से कुल्ला। कोशिकाओं के बंद DPBS ++ Aspirate।
    2. हुड में रहते हुए, 1 मिलीलीटर trypsin और 4 मिलीलीटर DPBS ++ के मिश्रण से ट्रिप्सिन और DPBS ++ का समाधान करें। प्रत्येक फ्लास्क solut के 5 मिलीलीटर की आवश्यकता हैआयन, इसलिए मिला हुआ बोतल की संख्या के लिए उचित मात्रा बनाते हैं। प्रत्येक फ्लास्क / trypsin DPBS ++ के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में डाल दिया।
    3. 2 मिनट के बाद, बोतल को हटाने और हल्के से नीचे से कोशिकाओं को ढीला करने के लिए उनमें से पक्षों नल। कोशिकाओं निलंबित कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के तहत प्रत्येक फ्लास्क को देखो। वापस सेल संस्कृति हुड में बोतल रखें और प्रत्येक फ्लास्क उचित सेल संस्कृति मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें। इस ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया समाप्त होता है।
    4. प्रत्येक कुप्पी से सेल से लदी मीडिया स्थानांतरण और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में डाल दिया है। 5 मिनट के लिए 1000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। कोशिकाओं शंक्वाकार के तल में एक छोटे सफेद गोली के रूप में प्रकट करना चाहिए। वापस सेल कल्चर हुड के लिए स्थानांतरण और मीडिया महाप्राण। सेल संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।
    5. माइक्रोस्कोप के तहत एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। कोशिकाओं में गिना गया है एक बार, मीडिया की संस्कृति हुड में, विभाज्य राशि ~ 1.3 millio युक्तएन कोशिकाओं और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार के लिए स्थानांतरण। अपकेंद्रित्र 1000 x जी पर 5 मिनट के लिए फिर से कोशिकाओं से युक्त 15 मिलीलीटर शंक्वाकार।
    6. संस्कृति हुड में, प्रत्येक फ्लास्क ~ 350,000 कोशिकाओं के एक एकाग्रता जोड़ने, कई टी -75 बोतल में शेष कोशिकाओं reseed। DMEM मीडिया के 15 मिलीलीटर जोड़ें और फिर से मिला हुआ है, जब तक इनक्यूबेटर पर लौटने।
    7. सेंट्रीफ्यूज चक्र पूरा हो गया है एक बार, सेल संस्कृति के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार वापसी। सेल गोली से मीडिया aspirate, और अक्सर समाधान terteriating, bioink की मिली लीटर प्रति 13 लाख कोशिकाओं की एकाग्रता में जलीय alginate समाधान में कोशिकाओं resuspend इसलिए bioink भर में कोशिकाओं का एक सजातीय वितरण है। एक बाँझ प्रिंटर-संगत 3 मिलीलीटर सिरिंज में सेल से लदी समाधान लोड और बाँझ 22 ग्राम प्लास्टिक नोक पर पेंच।

5. Bioprinter सेटअप

  1. Bioprinter, मशीन कंप्यूटरों में से प्रत्येक के लिए, और recirculat चालू करेंनहाने के पानी हैैं।
    1. मैन्युअल जमाना तंत्र के लिए करने के लिए recirculating पानी स्नान तापमान निर्धारित किया है।
    2. मैन्युअल correlating निकालने की मशीन कंप्यूटर पर प्रत्येक मशीन के लिए मुद्रण मानकों सेट। 0 करने के लिए backsteps के 230 NL, संख्या के बग़ैर मात्रा निर्धारित करें, और बांटना दर -sec 10μl करने के लिए।
  2. डिजाइन सॉफ्टवेयर और कंप्यूटर पर यूएसबी कैमरा के प्रदर्शन को देखने के लिए प्रोग्राम खोलें।
    1. सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, मैन्युअल बूंदों के बीच 2.4 मिमी रिक्ति के साथ एक 5 एक्स 5 डॉट सरणी के लिए निर्देशांक दर्ज करें।
    2. होना करने के लिए मुद्रण मानकों सेट: टिप अंत और सब्सट्रेट सतह के बीच की दूरी = 0.1 मिमी; ऊंचाई सिरिंज बयानों के बीच उठाया है = 20 मिमी; बयान के अनुसार समय की राशि 1 सेकंड =।
    3. कार्यक्रम को बचाने और रोबोट के लिए भेजें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस प्रिंटर मंच पर जिलेटिन / 2 Tio युक्त पेट्री डिश रखें। बंद करो और कक्ष के दरवाजे बंद कर लो।
  4. पहल करने के लिए पीएलसी का प्रयोग करेंपराबैंगनी प्रकाश स्रोतों tialize, और 90 सेकंड के लिए चैम्बर बाँझ।
  5. नसबंदी पूरा हो गया है एक बार, कक्ष खोलने के लिए और hADSC की बंदूक में alginate में निलंबित 1. पास युक्त सिरिंज लोड और कक्ष के दरवाजे बंद कर लो।
  6. , प्रशंसक प्रणाली मोड़ पर संतुलन आंतरिक दबाव के लिए 30 सेकंड प्रतीक्षा करने के लिए पीएलसी का प्रयोग करें।
  7. कंप्यूटर पर, ज्यामितीय मार्ग और मुद्रण के मापदंडों युक्त कार्यक्रम चलाते हैं।
  8. मुद्रण प्रक्रिया के दौरान, सटीक और वर्दी मुद्रण पुष्टि करने के लिए कंप्यूटर पर यूएसबी कैमरा के प्रदर्शन को देखते हैं।
  9. मुद्रण समाप्त हो जाने के बाद, निर्माणों 40 मिनट के लिए जेल के लिए अनुमति देते हैं।

6. सेल व्यवहार्यता का आकलन

  1. इमेजिंग के समय तक इनक्यूबेटर में तुरंत DMEM में बाद मुद्रण और दुकान imaged किया नहीं जा रहे हैं कि निर्माणों को कवर किया।
  2. निर्माणों की व्यवहार्यता यों, एक फ्लोरोसेंट आधारित व्यवहार्यता / cytotoxicity परख का उपयोग कर उन्हें दाग, एकconfocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग एन डी छवि।
    1. किट निर्देशों का पालन, calcein AM और ethidium homodimer -1 से युक्त एक धुंधला समाधान तैयार करते हैं। , धुंधला समाधान के 10 मिलीलीटर बनाने ethidium homodimer -1 के 20 μl और calcein के 5 μl को जोड़ने के लिए बाँझ के 10 मिलीलीटर के लिए कर रहा हूँ, टिशू कल्चर ग्रेड है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (+ मैग्नीशियम, + कैल्शियम, DPBS ++)।
    2. अंधेरे में 15 मिनट के लिए दाग समाधान में bioprinted निर्माणों को विसर्जित कर दिया।
    3. छवि 0 दिन और 8 पर एक confocal खुर्दबीन प्रणाली का उपयोग दाग निर्माणों एक 300 माइक्रोन गहराई पर 30 ऑप्टिकल स्लाइस के Z ढेर मापदंडों का उपयोग कर, प्रत्येक bioprinted निर्माण की कई तस्वीरें ले लो, और मैन्युअल कोशिकाओं गिनती। कोशिकाओं पीला दिखाई देते हैं या लाल है, तो हरी के रूप में उन्हें जिंदा गिनती, और करते हैं, तो उन्हें मृत के रूप में गिनती।
  3. निर्माण में कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित जीवित कोशिकाओं की संख्या के रूप में सेल व्यवहार्यता प्रतिशत की गणना; सेल व्यवहार्यता = की संख्याजीवित कोशिकाओं (ग्रीन + पीला) / कुल कोशिकाओं की संख्या (ग्रीन + लाल + पीला) 100% एक्स।
  4. 0 दिन पर सेल संख्या से विभाजित 8 दिन की सेल नंबर के रूप में प्रत्येक नमूने के लिए सेल प्रसार की राशि की गणना; दिन 8 / लाइव सेल पर सेल प्रसार = जीवित कोशिका गिनती दिन 0 एक्स 100% पर भरोसा।

7. RGD पेप्टाइड संयुग्मन विश्लेषण

  1. Alginate पर RGD पेप्टाइड विकार की सफलता का विश्लेषण करने के लिए, RGD संयुग्मित alginate और गैर-संयुग्मित alginate की तुलना करें। ('6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride 4) का उपयोग (DAPI) और phalloidin दाग इस, छवि मुद्रित निर्माणों ऐसा करने के लिए।
    1. DPBS ++ के 200 μl साथ methanolic शेयर समाधान के 5 μl गिराए द्वारा समाधान काम phalloidins बनाओ। उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    2. (0.10509 ग्राम / एल) / (350.3 छ / मोल) = 3 × 10 -4 एम = 0.0003 एम = 0.300 मिमी = 300 माइक्रोन: समीकरण निम्नलिखित DAPI दाग की 300 माइक्रोन शेयर समाधान करें। वें बनाओई DAPI के शेयर समाधान 1 गिराए द्वारा समाधान काम: ++ DPBS में 100 3 सुक्ष्ममापी समाधान प्राप्त करने के लिए। उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. पूरी तरह से 4% paraformaldehyde में नमूना डूब। आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। समाधान 5 मिनट प्रत्येक धोने के लिए बैठने के लिए अनुमति देता है, DPBS ++ के साथ तीन बार धोएं। इस प्रक्रिया में खत्म हो गया जेल flipping, एक गिलास स्लाइड करने के लिए अच्छी तरह से जेल नमूना हस्तांतरण। 10 मिनट के लिए DPBS में 0.1% ट्राइटन X-100 (0.1 ग्राम / 100 एमएल) ++ में जेल विसर्जित कर दिया। प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट के लिए अनुमति देता है, DPBS ++ के साथ तीन बार धोएं।
  3. काम समाधान में उन्हें डुबो कर phalloidin के साथ छपी निर्माणों दाग। पन्नी के साथ कवर और 4 घंटे के लिए सेते हैं। Phalloidin दाग हटाने और DPBS ++ के साथ तीन बार धोएं। पहली बार धोने उत्तरार्द्ध washes के 5 मिनट प्रत्येक के लिए बैठना चाहिए, तेजी से होना चाहिए।
  4. DAPI काम कर समाधान में उन्हें डुबो कर DAPI साथ मुद्रित निर्माणों दाग। पन्नी के साथ कवर और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। धुलाईप्रत्येक धोने की इजाजत दी DPBS ++ के साथ तीन बार, 5 मिनट के लिए बैठने के लिए। एक confocal खुर्दबीन प्रणाली पर नमूनों का निरीक्षण करें और छवि।

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Representative Results

परिणाम bioprinter सही रूप में विशिष्ट तीन आयामी स्थानों में सेल से लदी हाइड्रोजेल जमा करने और लगातार कंप्यूटर एडेड सॉफ्टवेयर का उपयोग करने में सक्षम है प्रदर्शित करता है। ये सॉफ्टवेयर प्रत्येक छोटी बूंद के स्थान का निर्धारण और चित्रा (3,4) के वितरण के लिए मापदंडों के कई नियंत्रित करते हैं। उचित रूप से biomaterials जमा करने के लिए bioprinter के repeatability ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में अपनी सफलता के लिए मौलिक है।

सेल व्यवहार्यता, एक सफल bioprinting तकनीक की आवश्यकताओं में से एक, 1 घंटा और बाद मुद्रण 8 दिनों विश्लेषण किया गया था। उच्च सेल व्यवहार्यता biomimetic निर्माणों fabricating के लिए आवश्यक है और एक पर्याप्त bioink का प्रत्यक्ष प्रतिनिधित्व है। RGD पेप्टाइड विकार के प्रसार सेल को बढ़ावा देकर समय की विस्तारित अवधि में सेल व्यवहार्यता को बेहतर बनाता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी मुद्रण प्रक्रिया के बाद निर्माणों में सेल व्यवहार्यता यों इस्तेमाल किया गया था। एक concentr साथ Alginate bioink15% और 5% का ऑक्सीकरण की व्यावहारिक एक दिन 0 98% की व्यवहार्यता, 96% के 4 दिन, और 95% के दिन 8 (चित्रा 5) था। इन परिणामों के प्रत्यक्ष लिखने bioprinter के बयान तकनीक के दौरान और मुद्रण प्रक्रिया के बाद व्यवहार्य रहते हैं कि निर्माणों का उत्पादन करने के लिए धीरे पर्याप्त कक्षों extrudes संकेत मिलता है (चित्रा 1, 2)। उच्च सेल व्यवहार्यता 5% ऑक्सीकरण और 15% एकाग्रता alginate bioink सेल बयान के लिए एक उपयुक्त वाहन था और सेल अस्तित्व के लिए एक पर्याप्त वातावरण प्रदान से पता चलता है। क्षेत्रों में से प्रत्येक में इसी प्रकार के सेल की गिनती alginate bioink में एक सजातीय सेल वितरण, मुद्रण संकल्प का एक मूलभूत पहलू दिखाया।

सबसे ऊतकों जटिल संयोजन और बाह्य मैट्रिक्स घटक, विशिष्ट जैविक और यांत्रिक प्रभाव के साथ प्रत्येक की ढ़ाल है। एक biomaterial देशी वातावरण की biomimetic हो सकता है और सेलुलर कार्यों की सुविधा चाहिए। alginate पाड़ की उच्च porosity की अनुमति देता हैकोशिकाओं संवाद और एक दूसरे के साथ नेटवर्क, और भी पाड़ और उसके आसपास के वातावरण के बीच पोषक तत्वों और चयापचयों के प्रवाह की सुविधा हो सकती करने के लिए। बाह्य मैट्रिक्स के लिए कोशिका आसंजन सेल प्रसार और कार्यात्मक ऊतकों में बाह्य मैट्रिक्स अणुओं के संगठन से पहले होता है कि ऊतक गठन के एक प्रारंभिक चरण में है। कोशिकाओं के प्रसार को घाव भरने और ऊतक विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इसलिए ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए bioprinted निर्माणों का विश्लेषण करते समय एक बहुत ही महत्वपूर्ण कारक है। मुद्रित निर्माणों में RGD संयुग्मित alginate बढ़ाया सेल लगाव, सुधार सेल प्रसार और प्रसार के लिए अग्रणी। मुद्रित scaffolds में कोशिकाओं के प्रसार के दिनों में तीन अलग-अलग क्षेत्रों में 0 और 8 (चित्रा 6) की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था। समग्र सेल प्रसार संस्कृति के 8 दिन बाद 219.674% हो पाया था। इन परिणामों के पाड़ एक प्रयोग किया जा करने के लिए पर्याप्त biocompatibility है दर्शाताक्षतिग्रस्त या अक्रिय ऊतकों की मरम्मत करने के लिए कोशिकाओं पहुंचाने के लिए SA सिंथेटिक बाह्य मैट्रिक्स।

Alginate bioink पर RGD पेप्टाइड विकार की सफलता का विश्लेषण करने के लिए, एक तुलना प्रयोग सेल से लदी, RGD संयुग्मित 15% एकाग्रता, 5% ऑक्सीकरण alginate bioink और सेल से लदी, गैर संयुग्मित 15% एकाग्रता, 5% ऑक्सीकरण उपयोग किया गया था alginate bioink। नाभिक और actin के लिए phalloidin धुंधला के लिए DAPI धुंधला (नमूना के अनुसार कम से कम तीन यादृच्छिक तस्वीरें) 30 से Z ढेर मापदंडों का उपयोग कर एक confocal खुर्दबीन प्रणाली का उपयोग कर ले जा रहे थे प्रत्येक नमूने के दिन पर छपी निर्माणों में 8. छवियाँ के प्रसार सेल का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया एक 300 गहराई पर ऑप्टिकल स्लाइस (चित्रा 7)। सेल RGD संयुग्मित alginate के साथ नमूना में दिखाया प्रसार alginate पर पेप्टाइड का सफल समावेश साबित होता है। सेल प्रवास ऊतकों के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है; इसलिए alginate पर RGD पेप्टाइड्स के विकार ली को बेहतर बनाता हैइस bioink का उपयोग कर इन विवो आवेदन की kelihood।

चित्र 1
चित्रा 1. पल्मेट्टो प्रिंटर। निर्देशयोग्य तर्क नियंत्रक सभी प्रिंटर कार्य (ए) के कार्यों का समन्वय करता है। फ़िल्टर्ड सेवन (सी) और निकास (सी) के साथ एक airtight नियंत्रण कक्ष (बी) के संदूषण की संभावना को कम करने के लिए एक विनियमित आंतरिक सकारात्मक दबाव बनाए रखता है। चैम्बर अधिकतम सीमा में रखा दोहरी यूवी लाइट (डी) सुरक्षित अंतराल पर संचालित करने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है। एक Janome 2300N xyz के रोबोट (ई) प्रोग्राम और एक एकीकृत कंप्यूटर (आई) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। तीन औषधि नियंत्रकों (जी) कंप्यूटर नियंत्रण में रोबोट जेड अक्ष हाथ (एच) पर लोड किया जा करने के लिए उपलब्ध निकालने की मशीन बंदूकों (एफ) के उत्पादन को विनियमित करने के लिए प्रोग्राम कर रहे हैं। रोबोट नमूना धारक का तापमान (जे) एक पानी के स्नान नियंत्रक (कश्मीर) द्वारा 4 और 40 डिग्री सेल्सियस के बीच निर्धारित है। दोहरी डिजिटल कैमरों (एल) उपलब्ध टी रहे हैं ओ प्रिंटर गतिविधि और नमूना गठन की निगरानी। एक कैमरा रोबोट जेड अक्ष बांह पर मुहिम शुरू की और भरी हुई बंदूक की नोक निकालने की मशीन के एक बढ़ाया छवि प्रदान करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. उपकरण नेस्ट, ऑप्टिक सेंसर, और Bioprinter का विस्थापन लेजर। सामने से ए उतार उपकरण घोंसला देखें। सामने से बी भरा उपकरण घोंसला देखें। सी ऑप्टिक सेंसर तीन आयामी अंतरिक्ष में वितरण टिप अंत मापने। जेड मुद्रण सतह के समन्वय को मापने डी दूरी लेजर। क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

ove_content "के लिए: रख-together.within-पेज =" हमेशा "> चित्र तीन
Bioprinted निर्माणों के बाहरी वास्तुकला डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया कंप्यूटर एडेड डिजाइन ड्राइंग सॉफ्टवेयर की चित्रा 3. दृश्य PathBuilder सॉफ्टवेयर। छवि। इस कार्यक्रम के संवर्द्धित स्थान दिया बूंदों और जटिल geometries उत्पन्न करने की क्षमता प्रदान करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. जे आर सी अंक सॉफ्टवेयर। प्रिंटर-संगत डिजाइन सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट। इस कार्यक्रम के बयान विधि को नियंत्रित करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है (यानी, एक बूंद बयान या सतत मार्ग जमाव), बयान गति, सिरिंज टिप अंत और मुद्रण सु के बीच की दूरी bstrate सतह, एक बूंद, और बूंदों (1 टेबल देखें) के तीन आयामी प्लेसमेंट के बयान के लिए आवंटित समय। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
Bioprinted 0 (ए) के बाद एक confocal खुर्दबीन प्रणाली (एक गहराई पर 30 ऑप्टिकल स्लाइस के Z ढेर पैरामीटर) का उपयोग कर लिया निर्माण और 8 में hADSC के दाग hADSCs बाद मुद्रण। सेल व्यवहार्यता / cytotoxicity के चित्रा 5. फ्लोरोसेंट छवि फ्लोरोसेंट छवियों ( बी) के दिन। hADSC के एक स्तनधारी सेल व्यवहार्यता / cytotoxicity परख का उपयोग बाद मुद्रण लेबल रहे थे। लाइव कोशिकाओं हरी दाग ​​रहे हैं, और मृत कोशिकाओं को लाल दाग रहे हैं।3156fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 Bioprinted निर्माणों की मात्रा निर्धारित viabilities। रहते हैं और मृत कोशिकाओं की संख्या एक व्यवहार्यता / cytotoxicity परख का उपयोग मात्रा था। 0 दिवस के लिए लाइव / मृत कोशिकाओं की गिनती (ए) में दिखाया गया है, और दिन 8 के लिए मायने रखता है (बी) में कर रहे हैं। 0 दिन और 8 पर प्रत्येक क्षेत्र के लिए गिना जीवित कोशिकाओं की संख्या (सी) में दिखाया जाता है और सेल प्रसार यों इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
सेल-लादेन, एन के 7 चित्रा तुलनापर संयुग्मित और RGD संयुग्मित Alginates। गैर संयुग्मित (ए) में bioprinted hADSC के फ्लोरोसेंट छवियों, और RGD संयुग्मित (बी) में 15% एकाग्रता 5% ऑक्सीकरण alginate bioink (जेड ढेर मापदंडों के एक confocal खुर्दबीन प्रणाली का उपयोग कर लिया गहराई में 30 ऑप्टिकल स्लाइस)। hADSC के निर्माणों में से प्रत्येक में फैल रहा सेल का विश्लेषण करने के लिए phalloidin और DAPI दाग के साथ दाग रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कमानों के पटल
आदेश रोबोट रिस्पांस
PTP प्वाइंट एक्स, वाई, जेड अंतरिक्ष में संकेत posiiton के लिए रोबोटिक बांह चालें
Find_Base_Z टी को मापने के लिए बीमार लेजर का उपयोग करता हैवह सब्सट्रेट की सतह मुद्रण; सिरिंज टिप अंत और सब्सट्रेट सतह के बीच की दूरी मैन्युअल रूप से सेट किया जाता है।
Adj काम करते हैं। सं (कार्य समायोजन संख्या) कमानों रोबोट गन 1, गन 2, या बंदूक 3, (सब्सट्रेट सतह का निर्धारण करने के लिए) बीमार लेजर का उपयोग करने के लिए।
Get_1 कमानों रोबोट ओ.टी. पुनः प्राप्त करने और गन एक लोड
Find_Tip1_YZ रोबोट वाई और जेड दिशाओं में गन 1 की नोक अंत पाता है
Find_Tip1_X रोबोट एक्स दिशा में गन 1 की नोक अंत पाता है
प्वाइंट बग़ैर रोबोट निर्धारित एक्स में bioink की एक छोटी बूंद बांटना होगा, वाई, जेड स्थिति
फूस की संख्या (Pallte संख्या) मुद्रण, जैसे, एक सरणी के लिए एक मैन्युअल कोडित डिजाइन शामिल हैं।
बग़ैर समय प्रत्येक व्यक्ति बूंद के बयान के लिए आवंटित समय है। </ टीडी>
Store_1 (0,0,0): toolnest को गन 1 लौटने के लिए, और घर की स्थिति पर लौटने के लिए रोबोट हासिल है।

तालिका 1. प्रोग्रामेबल कंप्यूटर सॉफ्टवेयर कमानों। इस चार्ट रोबोट भुजा पर नियंत्रण और printability मापदंडों का अनुकूलन करने के लिए उपयोग किया जाता है जो प्रोग्राम कंप्यूटर सॉफ्टवेयर आदेशों, रूपरेखा।

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Discussion

ऊतक इंजीनियरिंग के प्राथमिक ध्यान केंद्रित बहाल बनाए रखने, या देशी ऊतक कार्यात्मक सुधार करने में सक्षम जैविक विकल्प के विकास के द्वारा अंग की कमी और प्रत्यारोपण की जरूरत के बीच की खाई को पाटने के लिए है। यह आंतरिक geometr पर एक जटिल, anatomically सही बाहरी ज्यामिति, और सटीक नियंत्रण के साथ scaffolds के प्रत्यक्ष निर्माण के लिए प्रेरित किया। तीन आयामी bioprinting एक परत-दर-परत approac का उपयोग कर एक डिजिटल मॉडल से विभिन्न आकारों और आकार के तीन आयामी निर्माणों को पैदा करने के लिए इस्तेमाल एक पद्धति है। तीन आयामी biomimetic निर्माणों के निर्माण के ऊतक इंजीनियरिंग की उन्नति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

उत्पन्न निर्माण के biomimetic कार्यात्मक प्रभाव है कि डिजाइन की प्रक्रिया का महत्वपूर्ण पहलू हैं। biomaterial और सब्सट्रेट के तापमान को नियंत्रित करने की क्षमता हाइड्रोजेल के बीच बढ़िया तालमेल तंत्र और मुझे उनके के रखरखाव के लिए आवश्यक हैइसलिए हाइड्रोजेल भीतर सेल वितरण, प्रसार, और भेदभाव को प्रभावित chanical गुण,। अंगों कई प्रकार की कोशिकाओं से मिलकर बनता है, तो कई डिस्पेंसर विषम, ऊतक संरचनाओं की तरह उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण हैं। बाहरी वास्तुकला का कंप्यूटर एडेड डिजाइन अलग घाव या ऊतकों के लिए कस्टम ऊतक के विकल्प के उत्पादन की अनुमति देता है। यह रोगी विशेष प्रतिस्थापन के विकास के लिए आवश्यक है। यह एक दूसरे के साथ घनिष्ठ संपर्क में उचित कोशिकाओं रखने और उन्हें सेल सेल जंक्शनों तरह विवो में फार्म करने की अनुमति देकर ढांचे के भीतर सेल सेल रिश्तों को प्रभावित करता है क्योंकि आंतरिक संरचना भी उतना ही महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं संवाद और एक दूसरे के साथ नेटवर्क संवहनी नेटवर्क के रूप में और देशी ऊतकों में उनकी bioactivity नकल करने के लिए कैसे कोशिकाओं की सटीक स्थान निर्धारित करता है। तीन आयामी bioprinting bioink के भीतर ही ढंग से छितरी कोशिकाओं, साथ ही स्थानिक पी पर उत्कृष्ट सटीक प्रदान करता हैकोशिकाओं के lacement। सृजित मचानों भी सेल भेदभाव और बाह्य मैट्रिक्स तैयार करने के लिए आवश्यक है, जो उच्च स्थानीय सेल घनत्व है।

मज़बूती से और लगातार biomimetic हाइड्रोजेल के साथ मिश्रित व्यक्तिगत कोशिकाओं या कोशिकाओं के समरूप बूंदों dispenses कि एक 3 डी रोबोट bioprinter यहाँ प्रस्तुत। इसी bioprinters एक पूर्व संलयन प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल किया है। अंतर आसंजन परिकल्पना के अनुसार, व्यक्ति की कोशिकाओं को फ्यूज होगा और सेल surfac पर एकाग्रता और आसंजन अणुओं के वितरण पर आधारित का आयोजन, एक ढालना या इसी तरह की डिवाइस में रखा गया है। इन उपकरणों के पूर्व जुड़े हुए छड़ या तो मशीन में भरी हुई है और अन्य जुड़े हुए पूर्व या पूर्व बनाया छड़ पास में रखा जाता है कि अन्य ज्यामितीय आकार, बनाने के जो तब फ्यूज एक बड़ा ज्यामितीय shap में। अंत geometries के इन पूर्व बनाया संस्थाओं से निर्माण किया जा सकता है क्या द्वारा सीमित हैं। यहां लागू किया bioprinter एक अनूठा तापमान शामिलनियंत्रित वातावरण में जो कोशिकाओं और सेल-हाइड्रोजेल मिश्रण पूर्व संलयन की आवश्यकता द्वारा सीमित नहीं हैं। इन शर्तों के तहत, bioprinter अंतर आसंजन परिकल्पना पर पूरी तरह निर्भर नहीं है। हाइड्रोजेल सामग्री का समावेश सेल वितरण मार्गदर्शन में मदद मिलेगी और कोशिकाओं को फ्यूज करने के लिए अनुमति देते हैं, या नहीं, गुणों के आधार पर विशिष्ट प्रयोग के लिए वांछित कर सकते हैं। सेल encapsulation के लिए biomimetic हाइड्रोजेल का चयन भी सेल phenotype पर गहरा प्रभाव पड़ता है। सामग्री सेल लगाव, साथ ही सेल आकार और morpholog पर असर पड़ जाना जाता है। इस तरह, हाइड्रोजेल की चिपचिपाहट के रूप में रियोलॉजिकल विशेषताओं, सेलुलर microenvironmen पर उनके प्रभाव को नियंत्रित करती हैं। मूल निवासी alginate निष्क्रिय है और आसानी से phenotype के नियंत्रण में भाग लेने कोशिकाओं के साथ संवाद नहीं है। हालांकि, रासायनिक पेप्टाइड विकार और ऑक्सीकरण के माध्यम से संशोधित कर रहे हैं कि alginates का उपयोग करते हुए, जिसके परिणामस्वरूप निर्माणों degradability नियंत्रित और सेल में वृद्धि हुई प्रदर्शितलगाव, प्रवास, और proliferatio। एक biomaterial की physiochemical गुणों फेरबदल ऊतक शहरी प्रभावित कर सकते हैं।

एक द्रव-वितरण का उपयोग कर तीन आयामी bioprinting, प्रत्यक्ष लिखने मशीन मुद्रित निर्माणों के संकल्प की डिग्री द्वारा सीमित है, हाइड्रोजेल सामग्री, प्रारंभिक कोशिका मृत्यु के बाद मुद्रण की उपलब्धता, और biomimetic vascularize करने की क्षमता। Bioprinting की एक महत्वपूर्ण विशेषता इसकी संकल्प है। हर मुद्रण विधि सबसे छोटी प्राप्त विवरण के निचले तकनीकी सीमा के आकार के आधार पर परिभाषित किया गया है। मिनट विवरण के उच्च संकल्प, छोटे अधिकतम निर्माण: मुद्रित निर्माण की निचली सीमा आकार और प्राप्य पैमाने के बीच एक गतिशील संबंध नहीं है। bioprinter यह इसी तरह की मशीनों की तुलना में एक उच्च संकल्प दे रही है, अति विशिष्ट और संगठित पैटर्न में संस्करणों के रूप में छोटे रूप में 230 nl जमा करने के लिए सक्षम है। हाइड्रोजेल आमतौर पर होने के कारण bioprinting में इस्तेमाल किया गया है उनकेhydrophilicity, biocompatibility, बाह्य मैट्रिक्स के लिए संरचनात्मक समानता, और modificatio में आसानी। हाइड्रोजेल की उच्च पानी सामग्री उनके biocompatibility में सुधार, लेकिन बहुत उनकी यांत्रिक शक्ति और कम कर देता है। Bioadditive-विनिर्माण बाहर निकालना के दौरान तरल पदार्थ वितरण के लिए उचित यांत्रिक गुणों के साथ इष्टतम हाइड्रोजेल की कमी नहीं है। इसलिए, प्रतिरक्षा के रूप में निष्क्रिय रहे हैं सफलतापूर्वक तरल पदार्थ वितरण का उपयोग कर निकाला जा सकता है कि cytocompatible जमाना तंत्र है, और यह भी यांत्रिक के एक इष्टतम रेंज के साथ एक सेल से लदी मैट्रिक्स का उत्पादन है कि हाइड्रोजेल के विकास के लिए एक बड़ी मांग है। छपाई की प्रक्रिया से पहले, सेल से लदी हाइड्रोजेल bioink सेल का समझौता किए, समय की राशि के लिए सीरिंज में संग्रहित किया जाना चाहिए। मुद्रण प्रक्रिया के दौरान, बाहर निकालना के दौरान कोशिकाओं पर प्रेरित कतरनी तनाव भी उनके लिए हानिकारक हो सकता है। bioprinter इसलिए मैं के मुद्दे पर काबू पाने, अत्यधिक व्यवहार्य (> 90%) निर्माणों का उत्पादन करने में सक्षम हैnitial कोशिका मृत्यु। Vascularization, संचारण का समर्थन है, या bioprinted की biomimetic समारोह के संरक्षण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। ऑक्सीजन का प्रसार मीटर है; इसलिए बड़ा में हाइपोक्सिया एक है constructs bioprinted। परम्परागत तकनीकों बहुत उत्पाद्य scaffolds के आकार को सीमित करने, एम्बेडेड वाहिका साथ निर्माणों का उत्पादन करने में असमर्थ रहे हैं। bioprinter की सेल व्यवहार्यता आकलन 8 दिनों से अधिक मुद्रित निर्माणों में महत्वपूर्ण सेल प्रसार दिखाया। इसलिए, तकनीक सेल के विकास, संचार, और नेटवर्क के गठन, vascularization की आवश्यकताओं की अनुमति है कि मचानों उत्पन्न करने के लिए अपनी क्षमता साबित होता है।

bioprinter जल्दी से विशिष्ट पैटर्न में सेल से लदी हाइड्रोजेल जमा करने के लिए सामग्री की एक किस्म का उपयोग करने की क्षमता प्रदान करता है। इस तकनीक ट्यून करने योग्य गुणों के साथ विषम निर्माणों का उत्पादन करते हैं, यह समवर्ती बयान और प्रतिक्रियाशील मिश्रण के काबिल नहीं है। कुछ biomaterials के लिए, इस बयान से मुलाकात कीविभागाध्यक्ष जमाना तंत्र को बढ़ाने और पाड़ productio के लिए समय कम होता है। एक बहु-सिरिंज निकालने की मशीन के अलावा biofabrication तकनीक के लिए biomaterials के एक व्यापक रेंज अनुमति दे सकता है। हाइड्रोजेल विशेषताओं, सेल नेटवर्क के गठन, और निर्माणों के vascularization के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करेगा समय की एक लंबी अवधि में bioprinted निर्माणों में सेल गतिविधियों की जांच।

वर्णित bioprinter के बयान विधि आगे रोबोट स्थिति और एक पूर्व निर्धारित पैटर्न में पहले से जमा माल के शीर्ष पर जैविक सामग्री की बहुलता जमा करने के लिए तीन डिस्पेंसर ड्राइविंग शामिल कर सकते हैं। यह कदम एक तीन आयामी अंग या ऊतक का उत्पादन किया जाता है जब तक आरोही पैटर्न का उपयोग दोहराया जा सकता है। इसलिए, पल्मेट्टो प्रिंटर मज़बूती वाहिका और उच्च सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने में सक्षम है कि एक तीन आयामी निर्माण बनाने के लिए सेल से लदी हाइड्रोजेल वितरण के लिए उपयुक्त है, और कर सकता हैऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा।

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Acknowledgments

इस काम अनुदान सं ईपीएस 0903795 राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, एनआईएच NIDCR R01-DE019355 (MJY पीआई), और ग्रांट 8P20 GM103444 (YM पीआई) द्वारा सम्मानित किया गया के तहत सरकारी सहायता द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positioning Robot (JR2000 XYZ) Janome 
Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers Fishman Corporation
Optical Light Sensors:  Keyensce
Displacement Laser: OD Mini SICK
Recirculating Water Bath: Polystat Cole-Parmer EW-12122-02
USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP AnMo Electrionics/YSC Technologies AD7013MT
Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points Janome Comes with purchase of Janome Robot
Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder RatioServ Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads
Printer 3 cc Syringes:  Fishman Corporation 122051
22 G Dispenser Tips Fishman Corporation Z520122 
Calcium Chloride Dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Porcine Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Titanium Dioxide Sigma-Aldrich 13462-67-7
Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) FMC BioPolymer 9005-38-3
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 7647-01-0
Ethylene Glycol Mallinckrodt Baker, Inc 9300-01
Sodium Periodate Sigma-Aldrich 7790-28-5
hADSC Lonza PT-5006 Store in vials in liquid nitrogen until use.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Gibco Life Technologies 11965-092 Warm in 37 °C water before use.
Trypsin/EDTA Lonza CC-5012 Warm in 37 °C water before use.
Calcein AM Gibco Life Technologies C3100MP Store in the dark at -80 °C until use.
Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit Invitrogen Life Technologies L-3224 Store in the dark at -80 °C until use.
MES Hydrate Sigma-Aldrich M2933
N-Hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 130672
1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Sigma-Aldrich E1769  10 G
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium Life Technologies 14040133 Warm in 37 °C water before use.
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium Life Technologies 14190144 Warm in 37 °C water before use.
RGD Peptides International Peptides
Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain Invitrogen Life Technologies A22283 Store at -20 °C until use
(4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain Life Technologies R37606 Store at -20 °C until use

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References

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एक तीन औषधि कार्तीय प्रिंटर का उपयोग कर Bioprinted सेलुलर निर्माणों की व्यवहार्यता
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Dennis, S. G., Trusk, T., Richards, D., Jia, J., Tan, Y., Mei, Y., Fann, S., Markwald, R., Yost, M. Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer. J. Vis. Exp. (103), e53156, doi:10.3791/53156 (2015).

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