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Artículo de método

Simulación de un laboratorio de hierro (II) ricos sistema de afloramiento Precámbrico marina para explorar el crecimiento de bacterias fotosintéticas

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DOI:

10.3791/54251

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24 de julio de 2016

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1Department of Geosciences, University of Tuebingen, 2Department of Geological and Atmospheric Sciences, Iowa State University

En este artículo

Resumen

Hemos simulado un sistema de afloramiento marino ferruginosa Precámbrico en una columna de flujo continuo vertical, a escala de laboratorio. El objetivo era comprender cómo los perfiles geoquímicos de O 2 y Fe (II) evolucionar a medida que las cianobacterias producen O2. Los resultados muestran el establecimiento de una chemocline debido a la oxidación Fe (II) por fotosintéticamente producido O 2.

Resumen

Un concepto convencional para la deposición de algunas formaciones de hierro bandeado Precámbricos (BIF) parte de la premisa de que el hierro ferroso [Fe (II)] afloramiento de fuentes hidrotermales en el océano Precámbrico se oxida por el oxígeno molecular [O 2] producido por las cianobacterias. Los BIFs más antiguos, depositados antes de la Gran Oxidación (GOE) en alrededor de 2,4 billón años (Gy) hace, podrían haberse formado por la oxidación directa de Fe (II) mediante anoxigénicas photoferrotrophs en condiciones anóxicas. Como método para probar los patrones geoquímicas y mineralógicas que se desarrollan en diferentes escenarios biológicos, hemos diseñado una columna de flujo continuo vertical de 40 cm de largo para simular un anóxica Fe (II) ricos representante de un antiguo océano sistema de afloramiento marino a escala de laboratorio . El cilindro se llena con una matriz de perlas de vidrio poroso para estabilizar los gradientes geoquímicos, y muestras líquidas para la cuantificación de hierro podría ser tomado a lo largo de la columna de agua. El oxígeno disuelto sedetectado de forma no invasiva a través de optodes desde el exterior. Los resultados de los experimentos bióticos que participan los flujos de corrientes ascendentes de Fe (II) de la parte inferior, un gradiente de luz distinta de la parte superior, y cianobacterias presentes en la columna de agua, muestran una clara evidencia de la formación de Fe (III) precipitados minerales y el desarrollo de un chemocline entre Fe (II) y O 2. Esta columna nos permite probar las hipótesis para la formación de los BIFs mediante el cultivo de cianobacterias (y en el futuro photoferrotrophs) en condiciones simuladas marinos precámbricos. Por otra parte la hipótesis de que nuestra columna concepto permite la simulación de diversos ambientes químicos y físicos - incluyendo los sedimentos marinos o lacustres superficiales.

Introducción

El Precámbrico (4.6 a 0,541 Gy atrás) ambiente experimentó un aumento gradual de la fotosíntesis produce oxígeno (O2), quizás marcada por cambios bruscos en la denominada "Gran Oxidación" (GOE) aproximadamente a 2,4 Gy atrás, y de nuevo en el Neoproterozoico (1 a 0,541 Gy atrás) como O 2 atmosférico se acercó a los niveles modernos 1. Las cianobacterias son los restos evolutivos de los primeros organismos capaces de fotosíntesis oxigénica 2. Geoquímicas y la evidencia de modelado estudios apoyan el papel de los ambientes costeros poco profundos en albergar comunidades activas de cianobacterias o organismos capaces de fotosíntesis oxigénica o fototrofas oxigénica, generando oasis de oxígeno locales en la superficie del océano por debajo de un ambiente anóxico predominantemente 3-5.

La deposición de formaciones de hierro bandeado (BIF) del agua de mar a través de los puntos del Precámbrico al hierro (II) (Fe (II)) como una importante c geoquímicaonstituent de agua de mar, al menos localmente, durante su deposición. Algunos de los más grandes BIFs son depósitos de aguas profundas, formando fuera de la plataforma continental y el talud. La cantidad de Fe depositado es incompatible desde un punto de vista del balance de masa con (es decir, a la intemperie) fuente predominantemente continental. Por lo tanto, gran parte de la Fe debe haber sido suministrada desde la alteración hidrotermal del fondo marino o máfica ultramáfica corteza 6. Las estimaciones de la tasa de Fe depositados por fuera de los ambientes costeros son consistentes con Fe (II) que se suministra a la superficie del océano a través de la surgencia 7. Con el fin de Fe a ser transportado en las corrientes de surgencia, debe haber estado presente en la forma reducida, móvil - como Fe (II). El estado de oxidación medio de Fe conservado en BIF es 2,4 8 y por lo general se cree que BIF preservar Fe deposita en forma de Fe (III), que se forma cuando la surgencia Fe (II) se oxidó, posiblemente por el oxígeno. Por lo tanto, la exploración de los posibles mecanismos de oxidación de Fe (II) a lo largo de la pendiente environmeNTS es importante entender cómo se formó el BIF. Por otra parte, refinado caracterización geoquímica de sedimentos marinos ha identificado que las condiciones ferruginosas, donde se encontraba presente en una columna de agua anóxica Fe (II), fueron una característica persistente de los océanos en todo el Precámbrico, y no siempre se han limitado a sólo el tiempo y el lugar donde BIF fueron depositados 9. Por lo tanto, durante al menos dos mil millones de años de historia de la Tierra, las interfaces entre redox Fe (II) y O 2 en los océanos poco profundos eran probablemente un lugar común.

Numerosos estudios utilizan sitios modernos que son análogos químicos y / o biológicos de diferentes características del océano Precámbrico. Un buen ejemplo son los lagos, donde ferruginosas Fe (II) es estable y está presente en las aguas superficiales iluminadas por el sol, mientras que la actividad fotosintética (incluyendo por las cianobacterias) fue detectado 10-13. Los resultados de estos estudios proporcionan información sobre las características geoquímicas y microbianas de un óxica a anóxicas / ferchemocline ruginous. Sin embargo, estos sitios son generalmente estratificados físicamente con poca mezcla vertical 14, en lugar de las interfaces químicas que se producen en un sistema de surgencia, y se cree que apoyar la producción más oxígeno en la era precámbrica 4.

Un análogo natural para explorar el desarrollo de un oasis marino de oxígeno por debajo de una atmósfera anóxica, y por un sistema de afloramiento rico en Fe (II) en la columna de agua de la superficie iluminada por el sol no está disponible en la Tierra moderna. Por lo tanto, se necesita un sistema de laboratorio que pueden simular una zona de surgencia ferruginosas y también apoyar el crecimiento de las cianobacterias y photoferrotrophs. La comprensión y la identificación de los procesos microbianos y su interacción con un medio acuoso que representa la surgencia de agua de mar Precámbrico promueven la comprensión y pueden complementar la información obtenida del registro de la roca con el fin de entender completamente los procesos biogeoquímicos distintivos en la antigua Tierra.

Con ese fin, una columna a escala de laboratorio fue diseñado en el que se bombeó Fe (II) ricos en medio de agua de mar (pH neutro) en la parte inferior de la columna, y se bombea hacia fuera de la parte superior. La iluminación fue proporcionada en la parte superior para crear un 4 cm de ancho "zona fótica" que apoya el crecimiento de cianobacterias en la parte superior 3 cm. Los ambientes naturales son generalmente estratificada y estabilizado por los gradientes físico-químicas, como la salinidad o la temperatura. Con el fin de estabilizar la columna de agua sobre una escala de laboratorio, el cilindro columna fue empaquetada con una matriz de perlas de vidrio poroso que ayudó a mantener el establecimiento de patrones geoquímicos que se desarrollaron durante el experimento. Un flujo continuo de gas N 2 / CO 2 se aplicó para eliminar el espacio de cabeza de la columna con el fin de mantener una atmósfera anóxica reflectante de un océano antes de la GOE 15. Después se estableció un flujo constante de Fe (II), las cianobacterias se inocularon a través de la columna, y su growth fue supervisado por el recuento de células en muestras tomadas a través de los puertos de muestreo. El oxígeno se controló in situ mediante la colocación de láminas de optodos sensibles al oxígeno en la pared interior del cilindro de la columna y las mediciones se realizaron con una fibra óptica desde el exterior de la columna. especiación acuosa Fe se cuantificó mediante la eliminación de las muestras de los puertos de muestreo horizontal de profundidad de resolución temporal y se analizó con el método FerroZine. Los experimentos de control abióticos y resultados demuestran la prueba de concepto - que un análogo de escala de laboratorio de la columna de agua antiguo, mantenido en aislamiento de la atmósfera, es alcanzable. Las cianobacterias crecieron y produjeron oxígeno, y las reacciones entre Fe (II) y oxígeno eran resolubles. En este documento, se presenta la metodología para el diseño, preparación, montaje, ejecución y toma de muestras de tal columna, junto con los resultados de un plazo de 84 h de la columna mientras se inocularon con la cianobacteria marina Synechococcus sp. PCC 7002.

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Protocolo

1. Preparación de cultivo Medio

Nota: La información sobre el equipo necesario, los productos químicos y materiales para la preparación del medio de cultivo se muestra en la Tabla 1 itálicos códigos alfanuméricos entre paréntesis se refieren a los equipos detallados en la Tabla 2 y se muestra en la Figura 1..

  1. Preparar 5 litros de Marina fototrofo (MP) medio (denominado en lo sucesivo como "medio") siguiendo el protocolo de Wu et al. 16. Ajustar el pH a 6,8 usando HCl anóxica y estéril de 1 o 0,5 M NaCO3. Como fuente para el Fe (II), añadir 3,5 ml de una M anóxica 1 y estéril FeCl 2 solución al lograr una Fe final (II) de concentración de 500 mM después de filtrar la solución del medio en el paso siguiente.
  2. Almacenar la solución del medio a 5 ° C durante 48 horas con el fin de precipitar el carbonato y fosfato Fe (II) minerales. Fe (II) de suma y Fe resultados precipitación mineral en un pH el cambio, por lo tanto, volver a ajustar el pH de nuevo a 6,8. Filtrar el medio en una anóxica (100% N 2) de la guantera a través de una unidad de 0,22 micras filtro. Dispensar el medio filtrado en un frasco estéril de 5 l de vidrio (E.'1) dentro de una caja de guantes, y la tapa con un tapón de goma de butilo estéril.
  3. Enjuague el espacio de cabeza de la botella de medio con N 2 / CO 2 (v / v, 90/10) mediante la inserción de una aguja desechable conectado a la línea de gas en el tapón, y una segunda aguja que actúa como un orificio de ventilación. Asegúrese de cambiar el volumen del espacio de cabeza 10 veces. Por ejemplo, con un flujo de gas constante de 10 ml / seg, enjuagar el volumen del espacio de cabeza de 50 ml durante al menos 50 seg (comparar Hungate y Macy 17).
  4. Cubra la botella medio (E), que ahora está listo para usar con papel de aluminio y se almacena a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad para evitar la foto-oxidación de Fe (II). Permitir 3 días en preparación de medios.

2. Preparación de la Cultura

"> Nota:.. La cultura de Synechococcus sp PCC 7002 que se utiliza en el experimento de la columna se describe como marinos unicelulares género cianobacterias photoheterotrophic 18 Se fue proporcionada por el Dr. M. Eisenhut (Instituto de Bioquímica Vegetal, Universidad de Düsseldorf, Alemania) . Para el estudio actual del cultivo madre se hizo crecer en un medio anóxico MP sin Fe adicional (II).

  1. Preparar 100 ml de medio MP siguiendo el protocolo de Wu et al. 16 pero el cloruro férrico sustituto con 1 ml de citrato de amonio / L férrico a 6 mg / ml.
  2. En condiciones anóxicas (guantera, N2 100%), dispensar el medio en uno 120 ml botella de suero estéril, tapa con un tapón de goma de butilo estéril y engarzado con una cápsula de aluminio. Cambiar el espacio de cabeza de N 2 / CO 2 (v / v, 90/10) (comparar Hungate y Macy 17) e inocular con 5% del cultivo madre. Posteriormente almacenar el cultivo en una incubadora de luz a 25 ° C y 600 Lux a partir de una TunGsten bombilla.
  3. Desde Synechococcus sp. PCC 7002 es fotosensible, después de la transferencia, cubre la botella de suero con una toalla de papel fino para las primeras 24 horas de luz dentro de la incubadora. Deje que el cultivo crezca durante 6-8 días. La actividad fotosintética dará lugar a la oxidación de Fe no será estática para la escala de tiempo de crecimiento celular (II) y Fe (II), por lo tanto, transferir el cultivo después de 7 días para mantener Fe (II) en el medio y las células adaptadas a Fe (II).
  4. Monitor de la densidad celular mediante la toma de muestras para mediciones de la densidad óptica (DO): La densidad celular (células / ml) del cultivo se puede determinar a través de la absorbancia de la muestra de suspensión celular en una foto-espectrómetro para una longitud de onda de 750 nm 19. Una relación lineal entre OD 750 y el recuento de células microscópicas directas de una cultura en la fase de registro determinará la densidad absoluta de celda 20.
  5. Tan pronto como una densidad celular de 10 8 células / ml se alcanza,envolver la botella de suero con papel de aluminio con el fin de detener la producción de oxígeno por fotosíntesis.
  6. Retire el O 2 en la suspensión de células mediante el uso de un filtro de jeringa estéril de 0,22 micras unida a una larga (100 mm) aguja desechable insertado en el medio líquido. Enjuague el espacio de cabeza y la burbuja de la cultura con N2 / CO2 durante 5 min (comparar Hungate y Macy 17). Mantenga la muestra en la oscuridad hasta que la inoculación en la columna.

3. Preparación de artículos y piezas individuales para el montaje experimental

Nota: La información sobre el equipo necesario para la puesta en marcha experimental, cantidades y características se enumeran en la Tabla 2.   Las partes de los artículos que serán utilizados para el montaje experimental se preparan con antelación y están etiquetados individualmente con una sola letra mayúscula (AG), que se enumeran en la Tabla 2 y se muestran como primeros planos en la Figura 1 también. itálicas códigos alfanuméricos entre paréntesis en el protocolo se refieren a los equipos detallados en la Tabla 2 y se muestran en la Figura 1.

  1. Con el fin de preparar a los puertos de muestreo (D) para la columna, cerrar los puertos con tapones de caucho butílico de ajuste hermético (A.3). Inserte una aguja de acero inoxidable (D. ') en el tapón de goma de butilo. Asegúrese de que la punta de la aguja está en el centro de la columna.
    1. Conectar la aguja a un tubo de goma (D.2) y sellar la conexión con un tubo termorretráctil (D.3). Una el otro extremo del tubo para un pequeño conector Luer tubo de bloqueo ( 'D.5), sellar la conexión con un tubo termorretráctil (D.3) y cubrir el conector de tubo con una tapa de plástico apropiado (D.6) .
      Nota: Dependiendo del número deseado de orificios de muestreo es necesario para proporcionar un puerto principal con varios puertos de muestreo - therefovolver a insertar las agujas de acero inoxidable (D.1) en un ángulo oblicuo en el tapón de goma de butilo.
  2. Con el fin de conectar las botellas medianas y de descarga de la columna, modificar tapones de caucho butilo siguientes los siguientes pasos:
    1. Inserte dos capilares de acero inoxidable (E.3, E.4) en el tapón de goma de butilo (E.2). Conectar los tubos de goma apropiados (E.6) a estos capilares y sellar la conexión con los tubos de termocontracción (E.5).
    2. Añadir un conector de tubo (E.7) al otro extremo del tubo del capilar más largo (E.3) y también solucionar este conector con un tubo termorretráctil (E.5).
    3. Conectar una aguja de acero inoxidable (E.11) al extremo libre del otro tubo conectado al capilar más corta (E.4), sellar las conexiones con termorretráctil tubos (E.5), e inserte el otro extremo de la aguja de acero inoxidable en un tapón de goma de butilo más pequeño (E.10).
    4. Inserte dos capilares de acero inoxidable (G.3) en un tapón de goma de butilo grande (G.2) y adjuntar los tubos apropiados de goma (G.4); G.5. Conectar el extremo libre del tubo de goma corto (G.4) a un capilar de descarga botella medio (w2). Equipar el extremo libre del tubo más largo (G.5) con un conector de tubo pequeño (G.6). Repita estos pasos con el fin de preparar otro tapón de goma de butilo para una segunda botella de descarga.
  3. Preparar el tapón para el panel de distribución de fluido (F) mediante la inserción de dos agujas de acero inoxidable (F.3) en un tapón de goma de butilo (F.2) con el fin de producir dos líneas de medios de suministro para la columna. Adjuntar un tubo de goma (F.4) a cada una de las agujas y conecte un capilar botella medio (c1) a uno de los tubos de goma, respectivamente.
  4. A fin de preparar las glándulas de la línea de suministro de medio (B), conecte un mediocapilar de alimentación (c2) a un conector de tubo pequeño (B.3) con un tubo de goma (B.4). Repita este paso para la otra glándula de suministro del medio.
    1. Utilice el capilar de descarga más largo medio (W1) en lugar de preparar las glándulas de la línea de descarga medio y siga los pasos anteriores (compárese (B) en la figura 1).
      Nota: Es muy útil para etiquetar entrada y de salida con diferentes colores de cinta para ayudar en el montaje adecuado.
  5. Montar las piezas para el panel de intercambio de gases del espacio de cabeza (C) mediante la inserción de bloqueo Luer dos largas agujas de acero inoxidable (C.2) en un tubo de goma (C.1) y asegúrese de que las puntas de las agujas alcanzan 4 cm por fuera del otro extremo de la tubería. Llenar el tubo con pegamento Polímeros (C.8) y deje que el montaje en seco durante al menos 6 horas.
    1. Sin apretar llenar dos jeringas de vidrio cierre Luer (C.3) con algodón (C.4).
    2. Por separado, preparar dos frotación de butiloBER topes (C.5), uno con una aguja de acero inoxidable insertado (C.6) y el otro con una aguja de acero inoxidable (C.7). No conecte a las jeringas de vidrio, sin embargo.
  6. Preparar una jeringa de vidrio (E.8) lleno de algodón (E.9) para su uso posterior en línea con el paquete de botella y medio gas (GP).
  7. Se monta el equipo para un paquete de gas 10 L (GP) mediante la conexión de un tubo de goma (GP.1) en la válvula de gas de la manada. Insertar un conector de tubo (gp.2) en el extremo libre del tubo de goma. Repita este procedimiento para un segundo paquete de gas de 10 l.

4. Esterilización de la columna y el Equipo

Nota: Dependiendo de las propiedades de los materiales, el equipo se esteriliza por uno de los tres métodos siguientes:

  1. Esterilizar el equipo de vidrio mediante secado al horno (180 ° C durante 4,25 horas):
    1. Esterilizar el equipo necesario para hacer media (véase Tabla 1 y la sección 1.2) por separado y con antelación. Por lo tanto, preparar 2 x 5 botellas de vidrio L y cubrir la abertura y el cuello de botella con papel de aluminio. Paquete de 4 x 5 ml y 5 x 2 ml pipetas de vidrio en un recipiente resistente al calor y horno-esterilizar todo el equipo.
    2. Esterilizar el equipo para la columna establecido en una segunda etapa. Envolver las jeringas de vidrio (C.3; E.8; F.1 - preparado en la sección 3) con papel de aluminio y asegurarse de que los correspondientes tapones de caucho de butilo se eliminan.
    3. Colocar las perlas de vidrio (A.2) en un vaso de vidrio y cubrir la parte superior con papel de aluminio. También cubrir la placa de vidrio transparente (A.4), 4 x conectores de tubos grandes (B.2) y el conector de 3 vías (G.7) ​​con papel de aluminio y horno a esterilizar todo.
  2. Esterilizar en autoclave plásticos y líquidos en autoclave (120 ° C, 10 bar, 20 min):
    1. En el primer paso, steRilize el matraz Widdel con el medio, la solución -buffer NaHCO3 y 2 tapones de goma de butilo para la botella de vidrio de 5 l.
      Nota: tapones de goma de butilo se preparan primero por ebullición en agua ultrapura 3 veces y después en autoclave en un vaso de precipitados de vidrio con un poco de agua, cubierto con papel de aluminio. Los tapones húmedas son más fáciles de insertar en las botellas de vidrio.
    2. En una segunda etapa de esterilizar el equipo para la columna de montaje experimental. Con el fin de preparar la columna para la esterilización en el autoclave, envuelva la abertura superior, las rejillas de suministro de medios de comunicación, las salidas de descarga medios de comunicación, y la cámara de aire de ventilación con papel de aluminio antes de esterilizar.
    3. Cubrir los orificios de muestreo (D.'5) con los tapones de plástico apropiados (D.'6) y asegúrese de retirar las abrazaderas (D.4) antes de esterilizar.
    4. Envolver los tapones de goma de butilo y los capilares correspondientes para las botellas medianas y vaciado (E.2; 2 x G.2 - i preparadan la sección 3), los tapones más pequeños para las jeringas de vidrio (2 x C.5; E.'10 '; F.'2 - preparada en el apartado 3) y los capilares conectados a las glándulas de suministro y descarga medianas (s2; w1 - preparado en la sección 3.4) en papel de aluminio y esterilizar todo el equipo en el autoclave.
    5. Después de la esterilización, se seca la columna y equipo esterilizado en un horno a 60 ° C durante otras 4 horas.
  3. Dado que el tubo de la bomba (pt) no es esterilizable en autoclave, esterilizar en una solución de etanol (EtOH) (80% de EtOH, 20% de agua). Llenar un vaso de precipitados adecuado con EtOH-solución y colocar el tubo de la bomba en el mismo, asegurando que el tubo está completamente lleno de EtOH-solución. Tomar después de 3 horas y se envuelven directamente en papel de aluminio pre-esterilizada (horno-esterilizado) y dejar secar a temperatura ambiente durante 2 horas.

5. Montaje de la columna y el Equipo

  1. Colocar la columna (A) sobre una superficie plana y estabilizar con un soporte de laboratorio y abrazaderas. Asegúrese de trabajar en condiciones estériles (por ejemplo, dentro de 40 cm de un mechero Bunsen o bajo una campana de flujo laminar). Retire con cuidado el papel de aluminio de apertura superior y rellenar las perlas de vidrio esterilizados (A.2).
    1. Preparar el vidrio de reloj (A.4) con el fin de cerrar herméticamente la columna mediante la aplicación de la cola Polímeros (A.5) a la superficie interior en la zona donde va a estar en contacto con la columna. Pulse ligeramente el vidrio de reloj en su lugar en la parte superior de la columna con el fin de pegar las dos partes estrechamente juntos. Deje por lo menos 6 horas para la instalación se seque.
      Nota: Es posible colocar un alambre maleable estéril, bien entre el borde de la columna y el vidrio de reloj, con el fin de eliminar fácilmente el vidrio de reloj después del experimento.
  2. Mientras se trabaja en condiciones estériles unir las piezas siguientes a la columna:
    1. Conectar los tubos de goma (B.1) y los correspondientes conectores de tubo (B.2) a las rejillas de suministro y de descarga medianas (compárese con (B) en la figura 1).
    2. Conectar los conectores de tubos de las glándulas (B.3) para el suministro de los medios de comunicación y la descarga (preparado en el apartado 3.4) a los conectores correspondientes en la columna (compárese con (B) en la figura 1).
    3. Coloque el panel de intercambio de gases del espacio de cabeza (compárese con (C) en la Figura 1 - preparada en el apartado 3.5) a la cámara de aire de ventilación en la columna y conectar las jeringas de vidrio (C.3) a las correspondientes agujas de acero inoxidable (C.2) y de inserción los tapones de caucho butílico apropiadas (C.6; C.7 - preparados en la sección 3.5.2) en las jeringas de vidrio forrado de algodón (C.3).
  3. Inserte los tapones de goma de butilo para las botellas de disparo (2 x G.20; - preparado en el apartado 3.2) en dos frascos de vidrio 3 L estériles (G.1), y conecte los conectores de tubos de las botellas (G.6) al conector de 3 vías (G.7).
  4. Conectar el extremo libre del capilar glándula de descarga medio (w1) en el extremo libre de un capilar botella de descarga (w2) con tubo de bomba (pt). Repita este procedimiento para el segundo capilar glándula de descarga media y la segunda botella de descarga.
  5. Conectar el extremo libre de un capilar botella medio (s1) al extremo libre del capilar glándula de suministro del medio (S2) con el tubo de la bomba (pt). Repita este procedimiento para el segundo capilar botella medio y el segundo capilar glándula de suministro del medio.
  6. Montar el panel de distribución de fluido mediante la inserción del tapón con los capilares correspondientes (F.2 - preparada en el apartado 3.3) en la jeringa de vidrio del mediopanel de distribución (F.1).
  7. Conectar el panel de distribución de medio al conector del tapón de goma de butilo para la botella medio (E.7 - comparar F en la figura 1).
  8. Conecte la línea 2 de gas N / CO2 al panel de intercambio de gases del espacio de cabeza a la Luer Lock aguja de acero inoxidable (ver posición (LLF) en la Figura 1), y lavar la instalación de la columna y el sistema capilar con N2 / CO2 a baja presión (<10 mbar). Mantener una salida de gas en los extremos abiertos de los capilares botella medio (E.3), el 3-way conector (G. 7), y los puertos de muestreo (D.5). Por lo tanto, asegúrese de tener las tapas de los puertos de muestreo (D.6) ligeramente abiertas, para mantener las condiciones estériles a través de una sobrepresión de gas que fluye hacia fuera.
    1. Enjuague la instalación completa durante al menos 20 min.
      Nota: Además, es posible cerrar la outgassiaguja ng (C.6) del panel de intercambio de gases del espacio de cabeza con un tubo de goma apropiado y una abrazadera con el fin de aumentar la eficiencia de lavado de la instalación completa.
  9. Mientras tanto, llenar una bolsa de gas 10 L (gp) con N 2 / CO 2 (v / v, 90/10), después de 10 rondas de llenado y de purga (usando una bomba de vacío) todo el volumen para asegurar la bolsa es completamente anóxica . Asegúrese de cerrar la válvula del envase de gas después del llenado final. Repita este procedimiento con un segundo paquete de gas, pero cerrar la válvula después de la desaireación (es decir, dejar en blanco).
    Nota: El paquete lleno de gas N 2 / CO 2 estará conectado a la botella de medio con el fin de compensar el volumen de espacio de cabeza en aumento debido a la pérdida de medio mediante bombeo. El N2 / CO2 enrojeció, pero el paquete de gasolina vacío, después se conectará a las botellas de disparo con el fin de permitir que el gas se escape el espacio de cabeza debido al aumento de volumen de descarga de líquido.
  10. inserción tél butilo tapón de goma (E.10 - preparado en el apartado 3.2.3) con la jeringa de vidrio estéril llena de algodón (E.8 - preparada en el apartado 3.6).
  11. Coloque la botella medio llena y cerrada (E - preparado en el apartado 1) en el banco de laboratorio junto al tapón para la botella medio (E.2), y preparar para conectar el tapón a la botella de medio utilizando el siguiente procedimiento:
    1. Cierre el flujo de gas N 2 / CO 2 en el capilar (E.3) cerrando el tubo de goma correspondiente (E.5) con una abrazadera de manguera.
    2. Ligeramente levantar el tapón de goma de butilo de la botella de medio y lavar el espacio de cabeza con N 2 / CO 2 (50 mbar) en la horca a, algodón jeringa -filled esterilizado con una inclinación, la aguja larga de metal (1 mm x 140 mm) en el cuello de botella de la botella medio (comparar Hungate y Macy 17).
    3. Eliminar rápidamente el tapón de goma de butilo de la botella medio e insertar el tapón de goma de butilo preparado (E.2) en la botella de medio (E).
    4. Cambie la aguja de metal largo de la jeringa (utilizado anteriormente para el lavado del espacio de cabeza) a una aguja desechable (0,9 mm x 45 mm; ampliamente disponible) e inyectar en el tapón con el fin de lavar el espacio de cabeza de la botella de medio con N 2 / CO 2.
    5. Asegúrese de tener un ligero flujo de salida de gas en el extremo abierto de la jeringa de gas (E.8 - montado en la sección 5.10) conectado al tapón de la botella de medio. Enjuague el espacio de cabeza de la botella de medio (E) y la jeringa de vidrio (E.8) durante al menos 4 min.
  12. Mientras tanto, apretar los tapones de plástico (D.6) de los puertos de muestreo (D.'5) y cerrar el correspondiente tubo de goma (D.2) con una pinza (D.4).
    Nota: Si es necesario, abra elaguja desgasificación (C.6) del panel de intercambio de gases del espacio de cabeza de nuevo con el fin de mantener una salida de gas en el extremo abierto de la aguja.
  13. Coloque la bolsa de gas de 10 litros, llena de N2 / CO2 (preparado en la sección 5.9), en la mesa de laboratorio. Asegúrese de que el conector de tubo está en una posición próxima al extremo abierto de la jeringa de vidrio (E.8) conectado a la botella de medio.
  14. Después de inundar el espacio de cabeza de la botella medio (E) por lo menos durante 4 min, cierre la línea de gas N 2 / CO 2 de la jeringa de lavado y rápidamente tirar de la aguja de inyección hacia fuera del tapón (E.2). Ser liberado La sobrepresión restante de gas en el espacio de cabeza de la botella medio será a través de la jeringa de vidrio (E.8).
    1. Abrir rápidamente la válvula del paquete de gas y presione ligeramente en la bolsa para mantener una salida de N 2 / CO 2 con el fin de limpiar el tubo y el conector del paquete de gas.
    2. Tan pronto como la sobrepresión se libera de la botella de medio, conectar rápidamente el conector del paquete de gas (gp.3) al conector correspondiente de la jeringa de vidrio (E.8).
  15. Conectar una bolsa de vacío de 10 litros de gas (GP) que anteriormente se enrojeció 10 veces con N2 / CO2 (preparado en la sección 5.9) al puerto libre del conector de 3 vías (G.7) ​​conectado a las botellas de disparo. Asegúrese de mantener la válvula del envase de gas cerrado.
  16. Reducir la presión de la línea de N 2 / CO 2 gas (<0,1 mbar) en el panel de intercambio de gases del espacio de cabeza (C en la Figura 1; posición LLF) para mantener un flujo de salida de gas de la aguja de salida de gases (C.6).
  17. Insertar el tubo de la bomba (PT) en la bomba (P) y retire la abrazadera de la manguera desde el tubo de goma correspondiente (E.6) de la botella medio (E).
    1. Abra la válvula del envase de gas (GP)conectado a las botellas de descarga (g) para que el aire que se libera en el paquete de gas, mientras que las botellas de descarga se llenan con medio de flujo de salida.
  18. Arranca la bomba y controlar el panel de distribución de fluido (véase (F)) llenar con el medio. Asegúrese de eliminar el gas que queda en el panel ya que se llena sosteniéndolo en una posición invertida. se libera gas a través de los capilares que están conectados a la bomba.
  19. Monitor de la columna ya que se llena con medio, y ajustar la bomba a una velocidad de bombeo adecuada de 0,45 L / día, que se puede convertir a un flujo vertical de Fe 10 mM (II) / m 2 / d, con el fin de simular el flujo químico de interés.
  20. Instalar la fuente de luz (L) 2 cm por encima del extremo superior de la columna y cubrir los 10 cm superior alrededor de la columna con una cinta oscuro y / o papel de aluminio con el fin de evitar que la luz se irradia hacia fuera de la parte superior de la columna y la iluminación de la parte inferior de la columna. Cubrir la totalidadla instalación de una cubierta textil oscuro con el fin de evitar que la iluminación de la columna de fuentes de luz externas.

6. La inoculación de las bacterias en la columna

Nota: Para un experimento de control abiótico se salta este paso.

  1. Dado que el cultivo celular se inyecta directamente en la columna a través de los tapones de goma de butilo de los principales puertos de muestreo a lo largo del lado de la columna, asegúrese de tener preparada seis jeringas con agujas que son lo suficientemente largo como para alcanzar el centro del cuerpo de la columna.
  2. Esterilizar el exterior de los tapones de caucho de butilo de los seis puertos principales de muestreo en la columna (A.3) con una solución de EtOH (80%).
  3. Tener la botella de suero con el cultivo para la inoculación listo (preparado en el apartado 2) y esterilizar el tapón de goma de butilo mediante flameado varias gotas de solución de EtOH. Enjuague la jeringa con estéril N2 / CO2 antes de tomar una alícuota del cultivo. Tomar 1 ml de of la solución de células anóxicas e inyectarla en el centro de la columna a través de los tapones de goma de butilo de los principales puertos de muestreo (A.3).
    Nota: Dependiendo del crecimiento bacteriano, puede ser necesario ajustar la velocidad de bombeo (o incluso dejar de bombeo) durante los primeros días de la fase de retraso para el crecimiento celular y el desarrollo para evitar que los cultivos de ser lavado.

7. Muestreo

Nota: Con el fin de recoger muestras a través de los gradientes químicos que se desarrollan dentro de la columna, es necesario para iniciar el muestreo de los puertos de muestreo superior antes de los puertos más profundas, como se produce la pérdida de volumen. Asegúrese de que para mantener las condiciones estériles (por ejemplo, trabajando dentro de 40 cm de un quemador Bunsen o bajo una campana de flujo laminar).

  1. Recoger las primeras muestras de 24 horas después de la inoculación. Enjuague la jeringa que se usará para el muestreo con N estéril 2 / CO 2, con el fin de evitar la inyección de oxígeno en el sapuertos mpling (D). Asegúrese de llenar la jeringa con N2 / CO2 antes del muestreo.
  2. Eliminar rápidamente la tapa de plástico (D.6) e inserte la jeringa de muestreo en el conector de tubo (D.5). Mantener un pequeño espacio entre la jeringa y el conector de tubo. Liberar el gas de la jeringa y enjuagar el conector de tubo con N 2 / CO 2.
    1. Conectar firmemente la jeringa en el conector de tubo. Retire la abrazadera (D.4) y empezar a tomar una muestra de aproximadamente 1 ml.
  3. Después de extraer la muestra y antes de retirar la jeringa, fije la abrazadera (D.4). A continuación, retire la jeringa de muestreo y cerrar firmemente el conector del tubo (D.5) con la tapa de plástico correspondiente (D.6).
  4. Inmediatamente repetir los pasos 7.1-7.3 para el muestreo de cada puerto.
  5. Recoger el siguiente conjunto de muestras cada 24 horas.
    Nota: para muestras adicionales en diferentes intervalos de tiempo, es necesario eliminar una pequeña amporte de la muestra (por ejemplo, 0,2-0,4 ml) inicialmente antes de la muestra puede ser tomada, con el fin de eliminar el medio residual en el interior del tubo de muestreo y para lograr muestras representativas desde el interior de la columna.

8. Métodos de análisis

  1. Oxygen cuantificación:
    Nota: La concentración de oxígeno dentro del medio de flujo a través y el espacio de cabeza de la columna se cuantifica de forma no invasiva y no destructiva usando los sensores ópticos de oxígeno y el oxígeno sensible parches de papel de aluminio fluorescentes de 0,5 x 0,5 cm (los llamados optodes), pegada a lo largo de la pared de cristal interior de la columna utilizando pegamento de silicona (A.6). Se aseguró que el oxígeno parches de papel de aluminio sensibles son insensibles a las especies Fe con el fin de lograr lecturas fiables.
    1. Asegúrese de calibrar el software de ordenador con los parámetros de calibración apropiados para los optodes que se utilizan en la columna. Los sensores ópticos de oxígeno vienen con una calibrat específicaion para la medición utilizando un medidor de oxígeno correspondiente fibra óptica PC-controlada.
    2. Iniciar la medición y tener cuidado para mantener la fibra óptica de polímero de la metro de oxígeno en un ángulo recto a la lámina sensible al oxígeno que se pega dentro de la pared de cristal transparente de la columna.
    3. Repita la medición para cada punto de medición de O2 única en toda la columna.
  2. Fe (II) y el análisis de Fe total de muestras acuosas:
    1. Desde Fe (II) se oxida rápidamente por el oxígeno en el aire a pH neutro, estabilizar las muestras líquidas para acuosa Fe cuantificación (II) inmediatamente en solución 1 M de HCl. Para un volumen de muestra final de 1 ml de la mezcla de 0,5 ml de muestra de líquido con M HCl 0,5 ml 2.
    2. Cuantificar Fe total después de la incubación de una alícuota de la muestra 1 estabilizado-HCl M con hidrocloruro de hidroxilamina (10% p / v, en M HCl 1) durante 30 min. Este reactivo reduce todo el Fe (III) a Fe (II), que luego puede ser cuantificado mediante el ensayo de ferrozina 21.
    3. Realizar una ferrozine ensayo usando un lector de placas de microtitulación. Medir la absorbancia a una longitud de onda de 562 nm. Asegúrese de tener estándares dentro de la gama de Fe detectable (II) y las concentraciones totales de Fe.
      Nota: Si las concentraciones de Fe en la muestra de líquido superan calibraciones estándar, es necesario diluir la muestra estabilizada con HCl 1.
    4. Calcular la concentración de Fe (III) por la diferencia entre el total Fe y Fe (II).

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Resultados

experimento de control

Experimentos de control abiótico (10 días) muestran que las concentraciones consistentemente bajos de oxígeno (O2 <0,15 mg / L) sin fluctuaciones significativas en el Fe (II) -profile toda la columna de agua afloramiento. La formación de precipitados (presumiblemente Fe (III) (oxyhydr-) óxidos) en el depósito de medio y la ligera disminución de la concentración...

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Discusión

Las comunidades microbianas en el océano Precámbrico fueron regulados por, o modificados como resultado de, su actividad y las condiciones geoquímicas imperantes. En la interpretación de los orígenes de BIF, los investigadores generalmente inferir la presencia o actividad de los microorganismos basado en la sedimentología o geoquímica de BIF, por ejemplo, Smith et al. 23 y Johnson et al. 24. El estudio de los organismos modernos en ambientes modernos que tienen análogos g...

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Divulgaciones

Los autores tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Marcos Nordhoff ayudó en el diseño e implementación de conexiones de la tubería. Ellen Struve ayudó a seleccionar y adquirir los equipos utilizados.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Matraz Widdel (5 L)Ochs110015labor-ochs.de
Frascos de vidrio (5 L)RotilaboY682.1
carlroth.com Pipetas de vidrio (5 ml)51714labor-ochs.de
0.22 µ m Unidad de filtro Steritop (0.22  y micro; m Membrana de polietersulfona)MilliporeX337.1carlroth.com
Papel
Jeringa estéril de vidrio Luer Lock, rellena de algodónC681.1carlroth.com
Agujas de acero inoxidable Luer Lock (150 mm, 1.0  mm ID)201015labor-ochs.de
NaClSigma433209sigmaaldrich.com
MgSO4Sigma208094sigmaaldrich.com
CaCl2SigmaC4901sigmaaldrich.com
NH4ClSigmaA9434sigmaaldrich.com
KH< sub>2PO4SigmaP5655sigmaaldrich.com
KBrSigmaP3691sigmaaldrich.com
KClSigmaP9541sigmaaldrich.com
CilindroY310.1carlroth.com
7377.2carlroth.comPerlas
de vidrio (ø 0.55 - 0.7& nbsp; mm)11079105biospec.com
Tapón de caucho butílico (ø 1,2 cm)271024
labor-ochs.de Placa de Petri, vidrio (ø 8.0  cm)T939.1carlroth.com
PegamentoOTTOSEAL S68adchem.de
Lámina óptica del sensor de oxígeno (para el análisis de oxígeno, ver más abajo)– a petición –presens.de
Tubo de goma (35 mm, 7  mm ID)770350labor-ochs.de
Conector de tubo Luer Lock (3,0 mm, Luer lock macho = LLM)P343.1carlroth.com
Conector de tubo Luer Lock (3,0 mm, Luer lock hembra = LLF)P335.1carlroth.com
Tubo de goma (25 mm, 0,72 mm de diámetro interior)2600185newageindustries.com
Tubo de goma (50 mm, 7  mm ID)770350 labor-ochs.de
Aguja de acero inoxidable Luer Lock (150 mm, 1,0 mm ID)201015labor-ochs.de
Jeringa de vidrio Luer Lock (10 ml)C680.1carlroth.com
Algodón suelto –
Tapón de caucho butílico (ø 1,75 cm)271050labor-ochs.de
Aguja de acero inoxidable (40 mm, 1,0  mm ID)Sterican4665120bbraun.de
Aguja de acero inoxidable Luer Lock (150 mm, 1,5 mm ID)201520labor-ochs.de
: Pieza del conector hembra Luer Lock en C.7
PegamentoOTTOSEAL S68adchem.de
Aguja de acero inoxidable (120 mm, 0,7 mm ID)Sterican4665643bbraun.de
Tubo de caucho (40 mm, 0,74 mm de diámetro interior)2600185newageindustries.com
Tubo termorretráctil (35  mm, 3 mm ID encogido)541458 - 62conrad.de
Abrazaderade tubo STHC-C-500-4tekproducts.com
Conector de tubo Luer Lock (1,0 mm, LLF)P334.1carlroth.com
Tapón de plástico Luer Lock (LLM)CT69.1carlroth.com
Botella de vidrio (5 L)RotilaboY682.1carlroth.com
Tapón de caucho butílico (para GL45)444704labor-ochs.de
Capilar de acero inoxidable (300 mm, 0,74 mm de diámetro interior)56736sigmaaldrich.com
Capilar de acero inoxidable (50 mm, 0,74 mm de diámetro interior)56737sigmaaldrich.com
Tubo retráctil (35 mm, 3  mm de diámetro interior reducido)541458 - 62conrad.de
Tubo de goma (100 mm, 0,74 mm de diámetro interior)2600185newageindustries.com
Conector de tubo Luer Lock (1,0 mm, LLF)P334.1carlroth.com
Jeringa de vidrio Luer Lock (10 ml)C680.1carlroth.com
Algodón suelto –
Tapón de caucho butílico (ø 1,75 cm)271050labor-ochs.de
Aguja de acero inoxidable (40 mm, 0,8  mm ID)Sterican4657519bbraun.de
Jeringa de vidrio Luer lock (5 ml)C679.1carlroth.com
Tapón de caucho butílico (ø 1,75 mm)271050labor-ochs.de
Tubo de goma (40 mm, 0,74 mm DI)2600185newageindustries.com
Botella de vidrio (2 L)RotilaboX716.1carlroth.com
Tapón de caucho butílico (para GL45)444704labor-ochs.de
Capilar de acero inoxidable (50 mm, 0,74 mm de diámetro interior)56736sigmaaldrich.com
Tubo de caucho (30 mm x 0,74 mm de diámetro interior)2600185
newageindustries.com Tubo de caucho (100 mm x 0,74 mm de diámetro interior)2600185newageindustries.com
Conector de tubo Luer Lock (1,0 mm, LLF)P334.1carlroth.com
Luer Lock Conector de 3 vías (LLF, 2x LLM)6134cadenceinc.com
Fuente de luzSamsungSI-P8V151DB1USsamsung.com
Bomba peristalicaIsmatecEW-78017-35coleparmer.com
Tubería de bombeo (0.89  mm ID)EW-97628-26coleparmer.com
Capilar de acero inoxidable (200 mm, 0,74 mm DI)56736sigmaaldrich.com
Capilar de acero inoxidable (400 mm, 0,74 mm ID)56737sigmaaldrich.com
Lámina Supel-Inerte (Tedlar - PFC) Paquete de gas (10 L)30240-Usigmaaldrich.com
Tubo de goma (30 mm, 6  mm ID)770300labor-ochs.de Conector
tubo Luer Lock (3,0 mm, LLM)P343.1carlroth.com
Conector de tubo Luer Lock (3,0 mm, LLF)P335.1carlroth.com
Jeringa hermética al gas (20  ml)C681.1carlroth.com
Quemador–
Medidor de oxígeno de fibra óptica para la cuantificación de oxígenoPresensTR-FB-10-01presens.de
Bomba–
Pegamento de silicona para ópdos de oxígenoPresensPS1presens.de
de aluminio de vidrio Lana de vidrio para polímeros Posición de polímeros de Bunsen de vacío

Referencias

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