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Biochemistry

संकेतन प्रोटीन के समारोह की नक़ल करना: की ओर कृत्रिम संकेत पारगमन थेरेपी

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

संकेत पारगमन मार्ग लगभग हर सेलुलर प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सेल में तेजी से पर्यावरण के संकेतों पर प्रतिक्रिया करने की अनुमति देते हैं। 1 ये रास्ते अक्सर एक बाह्य रिसेप्टर, जो intracellular एंजाइमों के सक्रियण में परिणाम के लिए एक संकेत अणु के बंधन से शुरू हो रहे हैं। प्रवर्धन और सेल के भीतर इस संकेत के प्रसार प्रोटीन है कि प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का एक नेटवर्क है जिसमें एंजाइमों reversibly उच्च विशिष्टता के साथ सक्रिय कर रहे हैं के रूप में संकेत के समारोह द्वारा मध्यस्थता है। क्योंकि इन नेटवर्कों का अनियंत्रण अक्सर कैंसर के विकास की ओर जाता है, वहाँ के कैंसर का संकेत पारगमन चिकित्सा ', 2 जिससे दवाओं घातक संकेत दे रास्ते को बाधित करने के लिए तैयार कर रहे हैं स्थापित करने में ज्यादा रुचि रही है। हमने हाल ही में पारगमन चिकित्सा कि दवाओं की क्षमता अप्राकृतिक संकेत पारगमन मार्ग उत्पन्न करने पर निर्भर करता संकेत करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रस्ताव किया है।

इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करने के लिए, हमने हाल ही में एक कृत्रिम 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' 4 कि glutathione-S-ट्रांसफेरेज़ (जीएसटी) है, जो सक्रिय द्वारा एक कैंसर विरोधी प्रोड्रग की दरार को गति प्रदान करने प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF) सक्षम बनाता बनाया है नहीं अपनी प्राकृतिक बाध्यकारी साथी। इस 'ट्रांसड्यूसर' की संरचना एक विरोधी PDGF डीएनए aptamer कि जीएसटी के लिए एक द्विसंयोजक अवरोध करनेवाला के साथ संशोधित किया गया है के होते हैं। इसलिए, इस सिंथेटिक एजेंट के लिए बाध्यकारी साइटों के साथ अणुओं के एक परिवार के अंतर्गत आता हैविभिन्न प्रोटीन, dimerization के 5-7 जैसे रासायनिक inducers (CIDs) 8-10 और भी oligonucleotide सिंथेटिक अणु conjugates के आधार पर प्रोटीन बाँधने के समूह के लिए। 11-21

ऐसी प्रणालियों के डिजाइन अंतर्निहित सामान्य सिद्धांतों यहाँ बताया जाता है और synthesizing और इस पारंपरिक एंजाइमी assays के साथ 'ट्रांसड्यूसर' के समारोह के परीक्षण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की जाती हैं। इस काम के अतिरिक्त इस वर्ग है, जो intracellular प्रोटीन, प्रोटीन संचार मध्यस्थता करने के लिए और इसके परिणामस्वरूप, कृत्रिम कोशिका संकेत दे रास्ते प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की 'ट्रांसड्यूसर' विकासशील की सुविधा के लिए करना है।

चित्रा 1 रेखाचित्र के रूप में सिंथेटिक 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' है कि अप्राकृतिक प्रोटीन, प्रोटीन संचार मध्यस्थता कर सकते हैं के ऑपरेटिंग सिद्धांतों का वर्णन है। इस चित्रण, एक 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' है, जो prot के लिए सिंथेटिक बाँधने को एकीकृत मेंEins मैं और द्वितीय (मैं और द्वितीय बाँधने), मैं प्रोटीन का उत्प्रेरक गतिविधि है, जो अपनी प्राकृतिक बाध्यकारी साथी नहीं है ट्रिगर करने के लिए प्रोटीन द्वितीय सक्षम बनाता है। प्रोटीन द्वितीय के अभाव में, ट्रांसड्यूसर एंजाइम (प्रोटीन मैं) का उत्प्रेरक साइट बांधता है और अपनी गतिविधि (चित्रा 1, राज्य ii) को रोकता है। प्रोटीन द्वितीय को 'ट्रांसड्यूसर' के बंधन, तथापि, बांधने की मशीन मैं और प्रोटीन द्वितीय की सतह (चित्रा 1, राज्य iii) है, जो, के प्रभावी एकाग्रता एक परिणाम के रूप में प्रोटीन आई की ओर अपने संबंध को कम करता है के बीच बातचीत को बढ़ावा देता है ' समाधान में 'मुफ्त ट्रांसड्यूसर कम हो जाता है, जो ट्रांसड्यूसर प्रोटीन की हदबंदी की ओर जाता रहा जटिल और प्रोटीन मैं के पुनर्सक्रियन (चित्रा 1, राज्य चतुर्थ)। साथ में ले ली, इन चरणों तीन मौलिक सिद्धांतों कुशल 'ट्रांसड्यूसर' का डिजाइन अंतर्निहित उजागर: (1) एक 'ट्रांसड्यूसर' एक विशिष्ट बांधने की मशीन प्रोटीन लक्ष्य से प्रत्येक के लिए, (2) बातचीत betwe होनी चाहिएएन बांधने की मशीन द्वितीय और प्रोटीन द्वितीय बांधने की मशीन मैं और प्रोटीन रहा है, और (3) बांधने की मशीन के बीच बातचीत मैं प्रोटीन द्वितीय की सतह के साथ बातचीत करने के लिए सक्षम होना चाहिए की तुलना में मजबूत होना चाहिए। यह पिछले सिद्धांत जरूरी है कि मैं अकेला बांधने की मशीन की आवश्यकता नहीं है एक उच्च आत्मीयता और प्रोटीन द्वितीय की ओर चयनात्मकता होगा। इसके बजाय, यह हमारे हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक प्रोटीन से निकटता में एक कृत्रिम अणु लाने इस अणु और प्रोटीन की सतह के बीच बातचीत को बढ़ावा देने की संभावना है पर आधारित है। 19,22,23

आकृति 1

चित्रा 1:। 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' के ऑपरेटिंग सिद्धांतों 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' एक सक्रिय प्रोटीन मैं (राज्य i) से जोड़ा जाता है, यह अपनी सक्रिय साइट को बांधने की मशीन के माध्यम से मैं बांधता है और अपनी गतिविधि (राज्य ii) को रोकता है। प्रोटीन द्वितीय की उपस्थिति में, हालांकि, अनबाउंड 'रासायनिक टीransducer 'बांधने की मशीन द्वितीय, जो बांधने की मशीन मैं और प्रोटीन द्वितीय की सतह के बीच बातचीत को बढ़ावा देता है के माध्यम से प्रोटीन द्वितीय के साथ सूचना का आदान प्रदान। इस प्रेरित बांधने की मशीन मैं प्रोटीन द्वितीय बातचीत मैं जटिल और प्रोटीन के लिए मैं पुनर्सक्रियन (राज्य चतुर्थ)। बांधने की मशीन मैं के प्रभावी एकाग्रता, जो 'transducer' प्रोटीन की हदबंदी की ओर जाता है कम कर देता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

1. 'केमिकल ट्रांन्सड्यूसर' के संश्लेषण

  1. प्रारंभिक तैयारी
    1. एसिटिक एसिड के 114 मिलीग्राम और 400 मिलीग्राम ultrapure पानी के साथ triethylamine की 278 मिलीलीटर के मिश्रण से 2 एम triethylammonium एसीटेट (TeaÃ) बफर तैयार करें। 7 पीएच को समायोजित करें और एक अंधेरे बोतल में रखें 1 एल के अंतिम मात्रा के लिए पानी जोड़ने।
      नोट: यह समाधान साल के लिए स्थिर है।
    2. ultrapure पानी की 20 मिलीलीटर में एस्कॉर्बिक अम्ल के 18 मिलीग्राम भंग द्वारा एक 5 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड समाधान तैयार है। एक ताजा समाधान का उपयोग करें; समाधान एक दिन के लिए स्थिर है।
    3. 11 मिलीलीटर डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में ultrapure पानी के 10 मिलीग्राम और 58 मिलीग्राम के TBTA में तांबा (II) सल्फेट pentahydrate के 25 मिलीग्राम भंग द्वारा एक 10 मिमी घन (द्वितीय) / Tris (benzyltriazolylmethyl) अमाइन (TBTA) समाधान तैयार है। दो समाधान मिक्स। यह कमरे के तापमान पर रखें और प्रकाश से बचाने के लिए।
  2. संयुग्मन प्रक्रिया
    1. 80 μl में संशोधित oligonucleotide के 100 nmol (ODN -1) भंगताजा ultrapure पानी की। 2 एम Teaà के 20 μl जोड़ें, पीएच = 7 एस्कॉर्बिक एसिड (पानी में 5 मिमी) की एक ताजा बना समाधान के 80 μl जोड़ें।
    2. DMSO के 180 μl में azido संशोधित ethacrynic एसिड के 1.5 μmol (574.5 माइक्रोग्राम) को भंग करने और समाधान के लिए जोड़ें। समाधान 60 सेकंड के लिए आर्गन का उपयोग कर और जल्दी घन (द्वितीय) / TBTA समाधान (55% में 10 मिमी (वी / वी) DMSO / पानी) से 40 μl जोड़ने देगास।
    3. आर्गन के साथ फिर से शुद्ध, करीब कसकर, और रात भर हलचल।
    4. प्रतिक्रिया की प्रगति (मोबाइल चरण: ए) पर नजर रखने और आरपी-एचपीएलसी द्वारा साधना को शुद्ध 5% acetonitrile, 5% TeaÃ, 90% ultrapure पानी; बी) 65% acetonitrile, 5% TeaÃ, 30% ultrapure पानी)। 24

2. PDGF द्वारा जीएसटी गतिविधि को नियंत्रित

  1. प्रारंभिक तैयारी
    1. एक 8 मिमी अंतिम फॉस्फेट एकाग्रता और विज्ञापन प्राप्त करने के लिए ultrapure पानी की 16.1 मिलीलीटर के साथ मिश्रण फॉस्फेट बफर खारा (PBSx1) की 33.9 मिलीलीटर से परख बफर के 50 मिलीलीटर की तैयारीडी 2 MgCl के 23.8 मिलीग्राम एक 5 मिमी अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए।
    2. एक बफर 50 मिमी Tris पीएच 7.5, 50 मिमी NaCl युक्त प्रोटीन भंग द्वारा जीएसटी M1-1 के एक शेयर समाधान तैयार, 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), और 30 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए 5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)। -80 सी में छोटे aliquots में इस समाधान और दुकान फूट डालो। हौसले से पतला, खंड 2.1.5.1 के अनुसार, परख बफर में और बर्फ पर रहते हैं।
      नोट: समाधान के बारे में 5 घंटे के लिए स्थिर हो जाएगा, या जब तक वहाँ एंजाइम गतिविधि में कमी है।
    3. निम्नलिखित निर्देशों के अनुसार सब्सट्रेट तैयार:
      1. 100 मिमी स्टॉक समाधान के अंतिम एकाग्रता के लिए ultrapure पानी के 325 μl में कम glutathione (GSH) के 10 मिलीग्राम भंग। 2.1 मिमी काम कर समाधान के अंतिम एकाग्रता के लिए परख बफर के 979 μl में इस शेयर समाधान से 21 μl पतला।
      2. ई के 492 μl में (CDNB) 2,4-dinitrochlorobenzene के 10 मिलीग्राम भंग100 मिमी स्टॉक समाधान के अंतिम एकाग्रता के लिए thanol। 4.32 मिमी काम समाधान के अंतिम एकाग्रता के लिए एक परख बफर के 956.8 μl में शेयर समाधान से 43.2 μl पतला।
    4. एक 96 अच्छी तरह से थाली में, एक अलग लाइन (12 कुओं) में प्रत्येक सब्सट्रेट डाल दिया। समाधान के लिए तेजी से और आसान वापसी की अनुमति देने के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक में कम से कम 60 μl डालें। प्रकाश के संरक्षण के लिए एक एल्यूमीनियम शीट के साथ थाली कवर।
    5. परख बफर में निम्नलिखित स्टॉक समाधान तैयार:
      1. डिमर का 0.6 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए 50 से जीएसटी M1-1 पतला।
      2. एक 30 माइक्रोन के शेयर समाधान के लिए 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' पतला।
      3. 40 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए PDGF पतला।
      4. 250 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए PDGF aptamer पतला।
  2. 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' की उपस्थिति और PDGF में जीएसटी गतिविधि को मापने।
    1. एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया मैं सेट अपगतिज माप के लिए प्लेट पाठक एन।
      1. एक 'मानक प्रोटोकॉल' के रूप में एक नया प्रयोग बनाएँ।
      2. प्रक्रिया सेटिंग्स विंडो खोलने के लिए 'प्रक्रिया' पर प्रेस।
      3. विंडो के ऊपरी ओर की सूची पॉप अप में, प्लेट निर्माता के अनुसार चुन '384 प्लेट' टाइप।
      4. बाएँ मेनू पर प्रेस 'पढ़ने'।
      5. पहचान पद्धति 'Absorbance' चयन के बारे में।
      6. पढ़ें प्रकार के बारे में 'अंत बिंदु' चुनें।
      7. तरंगदैर्ध्य खिड़की पर 340 एनएम लिखें।
      8. ऊपरी दाहिने ओर 'पूरी थाली' तल पर प्रेस और अच्छी तरह से चयन मापा जाएगा।
      9. 'ठीक' दबाएं बंद करने के लिए 'पढ़ने' खिड़की।
      10. चुनें बाएँ मेनू पर 'गतिज शुरू'।
      11. चलाने के समय 10 मिनट बनाओ।
      12. न्यूनतम अंतराल विकल्प चुनें।
      13. 'ठीक है' प्रेस गतिज खिड़की बंद करने के लिए।
      14. 'पढ़ने' लाइन मैं खींचेंगतिज माप Nto।
      15. 'मान्य' बटन और फिर 'ठीक' बटन दबाएँ।
      16. प्रयोग की बचत करें।
      17. 'खेल' बटन दबाएँ। एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा - केवल 'ठीक है' बटन दबाएँ जब माप शुरू किया जाना चाहिए।
    2. आदेश, triplicates प्रयोग करने के चार नमूने 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' और जीएसटी M1-1 के 3.25 μl के प्रत्येक युक्त 3.25 μl तैयार करने के लिए। प्रत्येक नमूना 0, 1.2, 2.4, या PDGF और 123.5, 122.3, 121.1 का 4.9 μl, या परख बफर के 118.6 μl को क्रमश जोड़ें।
    3. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान सेते हैं।
    4. एक 384-पारदर्शी अच्छी तरह से थाली में, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए नमूना के 40 μl डालें। सब्सट्रेट इसके लिए एक बहु-pipettor के उपयोग की अनुमति के लिए एक ही अजीब कुओं में या केवल यहां तक ​​कि एक ही पंक्ति में कुओं में नमूने डालें।
    5. एक 12-चैनल बहु pipettor का उपयोग, जल्दी से टी में से प्रत्येक से 10 μl जोड़नेवह substrates कि 96 अच्छी तरह से थाली (धारा 2.1.4) में पूर्व तैयार की गई। धीरे और जल्दी मिश्रण बुलबुले से बचने के लिए। रीडर में थाली डालें और गतिज माप शुरू करते हैं। चूंकि जीएसटी कैनेटीक्स काफी तेज है, सब्सट्रेट अलावा और गतिज माप की शुरुआत के बीच के समय को कम करने के लिए प्रयास करें।
  3. जीएसटी एक्टिवेशन / निषेध साइकिल 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' द्वारा मध्यस्थता।
    1. आदेश, triplicates प्रयोग करने के लिए प्रत्येक परख बफर के 84.5 μl, 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' के 3.25 μl, और जीएसटी M1-1 के 3.25 μl युक्त 5 नमूने तैयार करने के लिए। 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    2. परख बफर के 3.65 μl नमूने 2-5 को PDGF की 1 और 3.65 μl नमूने के लिए जोड़ें। 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    3. नमूने 1-2 को परख बफर के 3.12 μl और नमूने 3-5 PDGF aptamer के 3.12 μl जोड़ें। 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    4. नमूने के लिए परख बफर के 24.4 μl जोड़ेनमूने 4-5 को PDGF 1-3 और 24.4 μl। 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने के लिए 5. सेते नमूने 1-4 और PDGF aptamer के 7.8 μl को परख बफर के 7.8 μl जोड़ें।
    6. एक 384-पारदर्शी अच्छी तरह से थाली में, प्रत्येक कुएं में नमूने के 40 μl डालें। केवल अजीब में या केवल यहां तक ​​कि एक ही पंक्ति में कुओं में डालने के नमूने हैं।
    7. (96 अच्छी तरह से थाली में पूर्व तैयार) एक 12 चैनल बहु pipettor का उपयोग, जल्दी से प्रत्येक सब्सट्रेट से 10 μl जोड़ें। धीरे और जल्दी मिश्रण बुलबुले से बचने के लिए। रीडर में थाली डालें और गतिज माप शुरू करते हैं।
    8. आयुध डिपो टी में 340 एनएम = आयुध डिपो से 0.5 मिनट टी में 340 एनएम = 1.5 मिनट पर मापा सक्रियण / निषेध recyclability का आकलन करने पर मापा को घटाकर वी 0 [मॉड / मिनट] प्रत्येक शर्त के तहत की गणना। 25
  4. पर्यावरण में परिवर्तन करने के लिए 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' की वास्तविक समय प्रतिक्रिया का मूल्यांकन।
      <li> PDGF अलावा की वास्तविक समय प्रभाव
      1. गतिज माप के लिए प्लेट रीडर में एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया निर्धारित करें।
      2. दोहराएँ 2.2.1.1-2.2.1.10 कदम।
      3. चलाते समय 3.5 मिनट बनाओ।
      4. न्यूनतम अंतराल विकल्प चुनें।
      5. 'ठीक है' प्रेस गतिज खिड़की बंद करने के लिए।
      6. गतिज माप में 'पढ़ने' रेखा खींचें।
      7. थाली बाहर / में बाएँ मेनू पर चुनें।
      8. 'बाहर प्लेट (कोई संवाद)' विकल्प चुनें।
      9. बाएँ मेनू पर 'देरी' विकल्प चुनते हैं और 30 सेकंड दर्ज करें।
      10. थाली बाहर / में बाएँ मेनू पर चुनें।
      11. विकल्प '(कोई संवाद) में थाली' चुनें।
      12. कदम 2.2.1.4 दोहरा द्वारा एक दूसरे गतिज माप बनाएँ - 2.2.1.14 लेकिन खंड 2.2.1.11 में गतिज सेट के बजाय 25 मिनट 10 न्यूनतम हो।
      13. 'मान्य' बटन और फिर 'ठीक' बटन दबाएँ।
      14. प्रयोग की बचत करें।
      15. 'पीएलए प्रेसवाई 'बटन। एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा - केवल 'ठीक है' बटन दबाएँ जब माप शुरू किया जाना चाहिए।
      16. जीएसटी M1-1 के 1 μl और परख बफर के 38 μl में 'केमिकल ट्रांसड्यूसर' के 1 μl मिश्रण से दो नमूने तैयार करें। एक 384-पारदर्शी अच्छी तरह से थाली के दो कुओं में नमूने डालें, इन दो कुओं के बीच एक खाली अच्छी तरह से छोड़ने।
      17. एक 12-चैनल बहु pipettor का उपयोग, जल्दी से, प्रत्येक सब्सट्रेट से 10 μl जोड़ने धीरे मिश्रण और जल्दी से बुलबुले से बचने के लिए पाठक में थाली डालने और गतिज माप शुरू करते हैं।
      18. जब प्लेट को खोलता है (3.5 मिनट के बाद), जल्दी से, कुओं में से एक को PDGF की 1.125 μl जोड़ने धीरे मिश्रण, और थाली शेष गतिज माप के लिए बंद करने के लिए अनुमति देते हैं।
    1. PDGF aptamer जोड़ने की वास्तविक समय प्रभाव
      1. दोहराएँ 2.4.1.1-2.4.1.15 कदम।
      2. जीएसटी M1-1 के 1 μl, 1 μl मिश्रण से दो नमूने तैयार 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर ', और परख बफर के 36.9 μl में PDGF की 1.125 μl। एक 384-पारदर्शी अच्छी तरह से थाली के दो कुओं में नमूने डालें, इन दो कुओं के बीच एक खाली अच्छी तरह से छोड़ने।
      3. एक 12-चैनल बहु pipettor का उपयोग, जल्दी से, प्रत्येक सब्सट्रेट से 10 μl जोड़ने धीरे मिश्रण और जल्दी से, बुलबुले से बचने पाठक में थाली डालें, और गतिज माप शुरू करने के लिए।
      4. जब प्लेट को खोलता है (1.5 मिनट के बाद), जल्दी से, कुओं में से एक को PDGF aptamer के 1.2 μl जोड़ने धीरे मिश्रण और प्लेट शेष गतिज माप के लिए बंद करने के लिए अनुमति देते हैं।
  5. उपाय जीएसटी से जे एस-कश्मीर प्रोड्रग एक्टिवेशन 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' और PDGF की उपस्थिति में।
    1. गतिज माप के लिए प्लेट रीडर में एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया निर्धारित करें।
      1. एक 'मानक प्रोटोकॉल' के रूप में एक नया प्रयोग बनाएँ।
      2. प्रक्रिया सेटिंग्स विंडो खोलने के लिए 'प्रक्रिया' पर प्रेस।
      3. विंडो के ऊपरी ओर की सूची पॉप अप में प्लेट निर्माता के अनुसार चुन '384 प्लेट' टाइप।
      4. बाएँ मेनू पर प्रेस 'पढ़ने'।
      5. के बारे में पता लगाने की विधि 'Absorbance' चुना है।
      6. पढ़ें प्रकार के बारे में 'अंत बिंदु' चुनें।
      7. तरंगदैर्ध्य खिड़की पर 305 एनएम लिखें।
      8. ऊपरी दाहिने ओर 'पूरी थाली' बटन पर प्रेस और अच्छी तरह से चयन मापा जाएगा।
      9. 'ठीक' दबाएं बंद करने के लिए 'पढ़ने' खिड़की।
      10. चुनें बाएँ मेनू पर 'गतिज शुरू'।
      11. चलाने के समय 10 मिनट बनाओ।
      12. न्यूनतम अंतराल विकल्प चुनें।
      13. 'ठीक है' प्रेस गतिज खिड़की बंद करने के लिए।
      14. गतिज माप में 'पढ़ने' रेखा खींचें।
      15. 'मान्य' बटन और फिर 'ठीक' बटन दबाएँ।
      16. प्रयोग की बचत करें।
      17. 'खेल' बटन दबाएँ। एक संवाद बोएक्स दिखाई देगा - केवल 'ठीक है' बटन दबाएँ जब माप शुरू किया जाना चाहिए।
    2. सं उत्पादन के लिए माप एक नाइट्राइट / नाइट्रेट उष्मापन किट का उपयोग करें। एक 96 अच्छी तरह से थाली में एक तीसरी पंक्ति में मैं एक दूसरी पंक्ति में अभिकर्मक Griess के 70 μl, और Griess द्वितीय अभिकर्मक के 70 μl एक पंक्ति में परख बफर के 50 μl डालें,।
    3. आदेश, triplicates प्रयोग करने के चार नमूने 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' के प्रत्येक युक्त 4.8 μl तैयार करने के लिए। नमूना 1, परख बफर के 155.2 μl जोड़ने के लिए; नमूना 2, जीएसटी M1-1 के 3.2 μl और परख बफर के 152 μl जोड़ने के लिए; नमूना 3, PDGF के 9.6 μl और परख बफर के 145.6 μl जोड़ने के लिए; और नमूने के लिए 4, जीएसटी M1-1 के 3.2 μl, PDGF के 9.6 μl, और परख बफर के 142.4 μl जोड़ें।
    4. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान सेते हैं।
    5. एक 384-पारदर्शी अच्छी तरह से थाली में, प्रत्येक कुएं में नमूने के 50 μl डालें। केवल अजीब में या केवल में सम्मिलित नमूनेयहां तक ​​कि एक ही पंक्ति में कुओं सब्सट्रेट इसके लिए एक बहु-pipettor के उपयोग की अनुमति है।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जे एस-कश्मीर के 0.54 μl (DMSO में 5 मिमी) जोड़ें।
    7. एक 12-चैनल बहु pipettor का उपयोग, जल्दी GSH समाधान से 10 μl जोड़ने (96 अच्छी तरह से थाली में पूर्व तैयार), धीरे मिश्रण और जल्दी से बुलबुले से बचने के लिए। रीडर में थाली डालें और गतिज माप शुरू करते हैं।
    8. इसके तत्काल बाद गतिज माप के बाद, एक 12-चैनल बहु pipettor का उपयोग, प्रत्येक नमूने से 50 μl परख बफर पंक्ति में पूर्व तैयार 96 अच्छी तरह से थाली में Griess मैं अभिकर्मक के 50 μl और 50 μl ले और जल्दी से इसे जोड़ने Griess द्वितीय अभिकर्मक। आरटी पर 10 मिनट के लिए प्रकाश से रक्षा करते हुए सेते हैं और 550 एनएम पर absorbance के उपाय।
      नोट: परख बफर और अभिकर्मकों की मात्रा किट 'प्रोटोकॉल पर निर्भर हैं।

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Representative Results

डिजाइन, संश्लेषण, और एक 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' है कि PDGF और जीएसटी के बीच कृत्रिम संचार पैदा कर सकते हैं की कार्रवाई की व्यवस्था चित्रा 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं। 'ट्रांसड्यूसर' की संरचना एक PDGF डीएनए aptamer और एक बीआईएस ethacrynic एमाइड एकीकृत (बीईए ) है, जो क्रमश: 26 एनएम और 144 एनएम, का एक ज्ञात जीएसटी अवरोध (चित्रा 2A)। 19 ये बाँधने (हदबंदी स्थिरांक के साथ, 'ट्रांसड्यूसर' दोनों PDGF और विभिन्न समानताएं, अर्थात् के साथ जीएसटी के लिए बाध्य करने के लिए सक्षम कश्मीर घ 's) । 4 इसके अलावा, इस डिजाइन के अनुसार, PDGF के लिए बाध्य बिया इकाई और PDGF की सतह है, जो स्पष्ट रूप से BEA अवरोध की शक्ति को कम करेगा के बीच गैर विशिष्ट बातचीत के लिए प्रेरित करना चाहिए। 19,22,23 चित्रा 2 बी को दिखाता है ऑपरेटिंग तंत्र इस प्रणाली अंतर्निहित। एक सक्रिय जीएसटी के लिए 'ट्रांसड्यूसर' जोड़ने पर,दो ईए इकाइयों के साथ-साथ इस dimeric एंजाइम की दोनों सक्रिय साइटों बाँध और अपनी गतिविधि को बाधित। PDGF की उपस्थिति में, हालांकि, एक PDGF-'transducer 'जटिल गठन किया है, जो जीएसटी बाधा से BEA इकाई से बचाता है। इस फलस्वरूप जीएसटी'transducer 'जटिल की हदबंदी के लिए और जीएसटी पुनर्सक्रियन की ओर जाता है। जीएसटी तो एक असंशोधित PDGF aptamer कि 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' विस्थापित और इसे फिर से जीएसटी को बाधित करने के लिए सक्षम बनाता है जोड़कर फिर से हिचकते जा सकता है।

जीएसटी गतिविधि को नियंत्रित करने की क्षमता PDGF पहले विभिन्न सांद्रता की उपस्थिति में साथ और 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' (500 एनएम) के बिना जीएसटी (10 एनएम) गतिविधि को मापने और जीएसटी'chemical ट्रांसड्यूसर 'जटिल की गतिविधि को मापने के द्वारा प्रदर्शन किया गया PDGF (250, 500, और 1000 एनएम) (चित्रा 3 ए) के। की स्थापना है कि 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' कृत्रिम PDGF-जीएसटी संचार लाती बाद, हमअगले स्थापना की है कि इस कृत्रिम संचार, संकेत पारगमन कदम के समान है, यह भी प्रतिवर्ती है और तेजी से पर्यावरण में परिवर्तन के लिए adapts। प्रतिवर्ती सक्रियण / जीएसटी के निषेध जीएसटी'chemical ट्रांसड्यूसर 'जटिल (चित्रा 3 बी) को PDGF और असंशोधित PDGF aptamer के अनुक्रमिक परिवर्धन द्वारा प्रदर्शन किया गया था। अपने वातावरण में वास्तविक समय में परिवर्तन करने के लिए प्रणाली की प्रतिक्रिया जीएसटी गतिविधि को मापने, जबकि विभिन्न आदानों जोड़कर मूल्यांकन किया गया था। जीएसटी गतिविधि में तेजी से वृद्धि 3.5 मिनट substrates (चित्रा 4 ए) जोड़ने के बाद जीएसटी'transducer 'परिसर (10 एनएम और 500 एनएम, क्रमशः) को PDGF के अलावा (750 एनएम) पर मनाया गया। इसी तरह, जीएसटी गतिविधि में कमी जीएसटी (10 एनएम), PDGF (750 एनएम) के एक मिश्रण करने के लिए PDGF aptamer (5 माइक्रोन) के के अलावा पर मनाया गया, और 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' (500 एनएम) (चित्रा 4 बी)।

एफinally, हम वातावरण में बदलाव के जवाब में प्रोड्रग सक्रियण नियंत्रित करने के लिए एक ऐसी प्रणाली की क्षमता का प्रदर्शन किया। जे एस-कश्मीर एक कैंसर विरोधी प्रोड्रग जीएसटी से सक्रिय विषाक्त सं (चित्रा 5 ए) जारी करने के लिए है। सं की राशि 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' (750 एनएम) और जीएसटी (10 एनएम) और PDGF (2 माइक्रोन) के विभिन्न संयोजनों को जे एस-कश्मीर (45 माइक्रोन) के के अलावा पर जारी किया मापा गया (चित्रा 5 ब), इस प्रकार की पुष्टि कि केवल दोनों जीएसटी और PDGF की उपस्थिति प्रोड्रग सक्रियण में परिणाम होगा।

चित्र 2
चित्रा 2. 'केमिकल ट्रांसड्यूसर' -। संश्लेषण और ऑपरेटिंग तंत्र (क) 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' एक PDGF aptamer, एक द्विसंयोजक ethacrynic एमाइड (ईए) जीएसटी अवरोध, एक fluorophore (परिवार) से बना है, और एक पेय (Dabcyl) । इस aptamer-अवरोध साधनाकरने के लिए एक azide संशोधित ethacrynic एमाइड (ईए) व्युत्पन्न संलग्न द्वारा संश्लेषित है एक dialkyne संशोधित और fluorescently लेबल डीएनए aptamer (ODN -1)। संदर्भ 4 से अनुमति के साथ फिर से छपी। (ख) जीएसटी के enzymatic गतिविधि की वजह से एंजाइम सक्रिय स्थलों पर ईए समूहों के बंधन को, 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' से हिचकते हैं। PDGF के अलावा PDGF-'chemical ट्रांसड्यूसर 'जटिल है, जो बाधित' transducer'-जीएसटी बातचीत के गठन की ओर जाता है इसलिए enzymatic गतिविधि बहाल। एक असंशोधित PDGF aptamer के निम्नलिखित इसके अलावा 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' जारी है और यह एंजाइम को फिर से बाधित करने की अनुमति देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
फाई। आंकड़ा 3: PDGF नियंत्रित जीएसटी गतिविधि (क) जीएसटी (10 एनएम) उपस्थिति में enzymatic गतिविधि (-) और अनुपस्थिति (-) 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' की (500 एनएम), और 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर की उपस्थिति में '(500 एनएम) बढ़ाने सांद्रता (250, 500, या 1000 एनएम) PDGF (---) के साथ। (ख) जीएसटी enzymatic गतिविधि के निषेध सक्रियण चक्र प्रारंभिक वेग में परिवर्तन के द्वारा प्रकट (वि 0) जीएसटी'chemical ट्रांसड्यूसर 'जटिल करने के लिए PDGF और असंशोधित PDGF aptamer के अनुक्रमिक अतिरिक्त (IIV) के जवाब में: (मैं) कोई नहीं, (द्वितीय) PDGF (750 एनएम), (iii) PDGF aptamer (4 सुक्ष्ममापी), (iv ) PDGF (5 माइक्रोन) के, और (v) PDGF aptamer (10 माइक्रोन) के। ग्राफ triplicates के stdev मतलब ± प्रस्तुत करता है। पुन: मुद्रित संदर्भ 4 से अनुमति के साथ। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।

चित्रा 4
। चित्रा 4: (-) जीएसटी गतिविधि की वास्तविक समय नियंत्रण (क) जीएसटी enzymatic गतिविधि का संवर्धन 750 एनएम PDGF के अलावा के बाद तुरंत पता लगाया एक समाधान जीएसटी (10 एनएम) युक्त और 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' (500 एनएम) से ( -) टी = 3.5 मिनट पर। (ख) एक असंशोधित PDGF aptamer (5 सुक्ष्ममापी) के अलावा (-) (-) टी में = 1.5 मिनट एक समाधान जीएसटी (10 एनएम), PDGF (750 एनएम), और 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' वाले (500 NM) enzymatic प्रतिक्रिया की दर में तत्काल कमी हो जाती है। पुन: मुद्रित संदर्भ 4 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 5:। नियंत्रित प्रोड्रग सक्रियण (क) जे एस-कश्मीर प्रोड्रग की जीएसटी सक्रियण विषाक्त नहीं रिलीज करने के लिए। (ख) 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' और जीएसटी (10 एनएम) और PDGF (2 माइक्रोन) के विभिन्न संयोजनों की उपस्थिति में नहीं रिलीज की। ग्राफ triplicates के stdev मतलब ± प्रस्तुत करता है। संदर्भ 4 से अनुमति के साथ बदल दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Acknowledgments

इस शोध मिनर्वा फाउंडेशन, HFSP संगठन, और एक यूरोपीय अनुसंधान परिषद अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (अनुदान 338,265 शुरू)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

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References

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Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

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