Genetisk manipulering av Plant Patogen<em> Ustilago maydis</em> Å studere Fungal Biology and Plant mikrobe interaksjoner

Summary

Vi beskriver en robust genet erstatning strategi for å genetisk manipulere sote sopp Ustilago maydis. Denne protokollen forklarer hvordan å generere delesjonsmutanter å undersøke smitte fenotyper. Den kan utvides til å modifisere gener i enhver ønsket måte, for eksempel ved å legge til en sekvens som koder for en fluorescerende protein tag.

Abstract

Gene sletting spiller en viktig rolle i analysen av genfunksjon. En av de mest effektive metoder for å forstyrre gener i en målrettet måte er utskifting av hele genet med en selekterbar markør via homolog rekombinasjon. I løpet av homolog rekombinasjon, utveksling av DNA finner sted mellom sekvenser med høy likhet. Derfor kan lineære genomiske sekvenser som flankerer et målgen kan brukes for spesifikt å dirigere en selekterbar markør til den ønskede integreringssete. Butte ender av konstruksjonen slettingen aktiverer cellens DNA reparasjonssystemer og derved fremmer integrering av konstruksjonen enten via homolog rekombinasjon eller ved ikke-homolog-ende-sammenføyning. I organismer med effektiv homolog rekombinasjon, kan graden av vellykket genet delesjon nå mer enn 50% gjør denne strategien en verdifull gen avbrudd system. Den sote sopp Ustilago maydis er en eukaryot modell mikroorganisme som viser en slik effektiv homolog rekombinantion. Ut fra sine ca 6900 gener, mange har blitt funksjonelt preget med hjelp av delesjonsmutanter, og gjentatt svikt i genet erstatning forsøk punkter viktig funksjon av genet. Påfølgende karakterisering av genet funksjon ved å merke med fluorescerende markører eller mutasjoner av predikerte domener er også avhengig av DNA utveksling via homolog rekombinasjon. Her presenterer vi U. maydis belastning generasjon strategi i detalj ved hjelp av de enkleste eksempel genet sletting.

Introduction

Ustilago maydis er en fytopatogene modell sopp som har blitt studert i flere tiår ^1,2. Det finnes i to morfologi, en gjær-aktig, ikke-patogene scenen og en trådformede, smittsomme skjema ^3. Universal gjennombrudd funn som homolog rekombinasjon og DNA-reparasjonsmekanismer ble gjort i gjær-lignende vekst stadium av denne soppen ^4. Videre morfologiske bryteren til smittsomme filament og virulensfaktorer viktige for smitte er godt karakterisert ^5,6. Den økende molekyl kunnskap om biologi og virulens av denne sote sopp er avhengig av en enkelt gen erstatning strategi ^7-9 støttet av en utmerket genom merknad ¹⁰ og den enkle revers genetikk bruker, for eksempel den velorganiserte plasmid samlingen på vårt institutt (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardiserte, raske smitteforsøk i mais seedlings tillate detaljerte studier av patogenitet faktorer ^11.

Genomet til U. maydis inneholder rundt 6900 gener ^10. For å studere deres funksjon, kan de slettes enkeltvis eller i kombinasjon på grunn av en effektiv homolog rekombinasjon system. Flankerende regioner av omtrent 1 kb inneholdende en perfekt homologe ender er ideelle for forekomst av homolog rekombinasjon større enn 50%, men allerede 250 bp med ikke-homologe ender tillate en viss grad av riktig integrering av konstruksjonen ^9. Foreløpig fem forskjellige motstands kassetter, hygromete, cbxR, natR, G418R og phleoR formidling motstand mot hygromycin, karboksin, nourseothricin, G418 og phleomycin, er ansatt for å velge for trans ^7,9. I tillegg har hygromycin resistens blitt utviklet til en resirkulerbar kassett (FRT-hygromete) som kan fjernes ved den forbigående ekspresjon av et heterologt FLP rekombinase ¹². Dette tillater fjerning av motstanden kassetten og derved i teorien ubegrenset genetiske modifikasjoner. Phleomycin er mutagent ^13, slik at med de nye kassetter, spesielt den resirkuler hygromete kassetten, bruk av phleoR er avtagende. Firedoble mutanter kan således bli generert ved hjelp av de øvrige fire kassetter, men for firemannsrom mutanter, blir FRT-hygromete system anbefales ^14.

Denne generelle strategien genet sletting har blitt overført til andre sote sopp som Sporisorium reilianum ^15, U. hordei ^16, eller U. esculenta ¹⁷ og derfor tilbyr muligheter for videre søknader i ennå genetisk låste organismer med en effektiv homolog rekombinasjon system. Videre kan organismer som mangler homolog rekombinasjon bli modifisert for å forbedre genetisk modifisering som eksemplifisert ved sletting av gener som er involvert i ikke-homolog-end-bli med i Neurospora crassa ^18,19.

Her beskriver vi publiserte genet sletting strategi for U. maydis ^7,9 i eksperimentell detalj med fokus på rask og nøyaktig verifisering av kandidatene. Som et eksempel, bruker vi sopp kitinaser og skildrer generasjonen av enkelt mutanter samt flere sletting stammer ^20,21. Kitinaser er interessante eksempler, fordi de handler på kitin i den stive celleveggen. Celleveggen ombygging er nødvendig for morfologiske endringer under celledeling, bytte til trådformede vekst, og sporedannelse. Derfor, i delesjonsmutanter fenotyper gjennom hele livssyklusen kan forventes.

Protocol

1. generasjon Sletting konstruerer Generer et plasmid inneholdende konstruktet delesjon (figur 1) som omfatter et respektivt 1 kb oppstrøms flanke (UF) og nedstrøms flanke (DF) hver, og den passende motstand kassetten flankert av butte skjærerestriksjonsseter. MERK: Enhver kloning strategi kan brukes (for kloning se referanse 22) anbefaler vi Golden Gate kloning for slike plasmider 9. Eksisere sletting konstruere fra plasmidet ved hjelp av en stump cu…

Representative Results

Slettingen konstruksjoner for alle fire kitinolytiske gener kodet i U. maydis genom ble generert ved Golden Gate-kloning med hygromete kassett for sletting av cts1, den natR for sletting av cts2, den G418R kassett for sletting av cts3 og cbxR for sletting av cts4 20. En generell oversikt over de generstat strategien er eksemplifisert ved sletting av cts3 (figur 1). Enkle …

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan å generere delesjonsmutanter for omvendt genetiske studier i U. maydis. Utgangspunktet er en delesjon konstrukt som inneholder flankerende sekvenser av genet interesseinneholdende sekvenser av omtrent 1 kb oppstrøms for start og nedstrøms fra stopp-kodonet, så vel som en passende motstand kassett som den tidligere ble optimalisert ^7,9 . Konstruksjonene har å være individuelt genereres for hvert gen og nøye kontrollert for sekvensfeil før sletting av genet. …

Materials

Aminobenzoeic acid (Free Acid)	Sigma Aldrich	A-9878
Bacto Agar	BD	214010	alternatively use local supplier
Bacto Peptone	BD	211677	alternatively use local supplier
Bacto Yeast Extract	BD	212750	alternatively use local supplier
CaCl2*2H2O	Grüssing GmbH	10234	alternatively use local supplier
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt)	Sigma Aldrich	P-2250
Carboxin	Sigma Aldrich	45371
Casamino acids	BD	223050
Cholinchlorid	Sigma Aldrich	C-1879
Citric acid	ChemSolute	24,321,000	alternatively use local supplier
CuSO4*5H2O	Fluka	61240	alternatively use local supplier
D(+)Sucrose	Roth	4621.1	alternatively use local supplier
DNA degr. free acid	Sigma-Aldrich	D-3159
EDTA	Sigma Aldrich	E4378
FeCl3*6H2O	Grüssing GmbH	10288	alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720
Trichoderma lysing enzymes	Sigma Aldrich	L1412
Glucose	Caelo	2580	alternatively use local supplier
Glycerin	Fisher Chemical	G065015	alternatively use local supplier
H3BO3	AppliChem	A2940	Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium salt	Sigma Aldrich	H3393-50KU
Hygromycin B-solution	Roth	1287.2	Dangerous substance.
KCl	VWR	26764298	alternatively use local supplier
KH2PO4	AppliChem	A3620	alternatively use local supplier
MgSO4 waterfree	Merck	7487-88-9	Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2O	AppliChem	A2087	alternatively use local supplier
myo-Inositol	Sigma Aldrich	I-5125
Na2-EDTA*2H2O	AppliChem	A2937	alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2O	Roth	0274.2	alternatively use local supplier
Na2SO4	Grüssing GmbH	12174	alternatively use local supplier
NaCl	Fisher Chemical	S316060	alternatively use local supplier
NaOH	ChemSolute	13,751,000	alternatively use local supplier
NH4NO3	Roth	K299.1	alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free Acid)	Sigma Aldrich	N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate	Werner BioAgents	5,001,000
Nutrient broth	Difco		local suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7	Sigma Aldrich	P3803	Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG)	Sigma Aldrich	P-3640
Potassium acetate	AppliChem	121479	alternatively use local supplier
Pyridoxin (Monohydrochlorid)	Sigma Aldrich	P-9755
Riboflavin	Sigma Aldrich	R4500
RNaseA	Sigma Aldrich	R5503
SDS	Roth	Cn30.3	alternatively use local supplier
small syringe	BD	300300	alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µm	VWR	28145-477	alternatively use local supplier
Sorbitol	Roth	6213.1	alternatively use local supplier
Thiamin-Hydrochloride	Serva	36020.02	alternatively use local supplier
tri-Na-Citrate	Fisher Chemical	S332060	alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane	VWR	103156X	alternatively use local supplier
Tris hydrochloride	Roth	9090.4	alternatively use local supplier
Triton X-100	Serva	37240	alternatively use local supplier
ZnCl2	Fluka	96470	alternatively use local supplier
Name	Company	Catalog Number	Comments
Composition of solutions/preparation of material			Composition of solutions
Carboxin			Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates			0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose
Geneticin (G418)			Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm)			Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal.
Heparin			Stock: 15 mg/ml
Holliday salt solution			16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution			0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
Hygromycin			Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
Nourseothricin			Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium			0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%)
RegLight			1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8			Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 8			1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG			40 % (v/v) PEG in STC-buffer
TE buffer, pH 8			1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase			10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements			0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution			12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5			806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 8			10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter.
Usti-lysis buffer 2			mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium			1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar