Genmanipulation av växtpatogen<em> Ustilago maydis</em> Att studera Svamp biologi och växt mikrobinteraktioner

Summary

Vi beskriver en robust gen ersättningsstrategi för att genetiskt manipulera smut svampen Ustilago maydis. Detta protokoll beskriver hur man skapar deletionsmutanter att undersöka infektion fenotyper. Den kan förlängas för att modifiera gener på något önskat sätt, t ex, genom att lägga till en sekvens som kodar för ett fluorescerande protein tagg.

Abstract

Gendeletion spelar en viktig roll i analysen av genfunktion. En av de mest effektiva metoder för att störa gener i ett målinriktat sätt är utbyte av hela genen med en selekterbar markör via homolog rekombination. Under homolog rekombination sker utbyte av DNA mellan sekvenser med hög likhet. Därför kan linjära genomiska sekvenser som flankerar en målgen användas för att specifikt rikta en selekterbar markör till den önskade integrationsstället. Trubbiga ändar deletionskonstruktionen aktiverar cellens DNA-reparationssystem och därigenom främja integrationen av konstruktionen antingen via homolog rekombination eller genom icke-homolog-end-medlemskap. I organismer med effektiv homolog rekombination, kan hastigheten för framgångsrik gendeletion uppgå till mer än 50% vilket gör denna strategi ett värdefullt genavbrott system. Den smuts svampen Ustilago maydis är en eukaryot modell mikroorganism som visar sådan effektiv homolog recombinatJon. Av dess cirka 6900 gener, många har funktionellt karakteriseras med hjälp av deletionsmutanter och upprepad underlåtenhet av genen ersättningsförsök pekar på grundläggande funktion av genen. Efterföljande karakterisering av genfunktion genom att märka med fluorescerande markörer eller mutationer av förväntade domäner bygger också på DNA-utbyte via homolog rekombination. Här presenterar vi U. maydis stam generation strategi i detalj med hjälp av det enklaste exemplet, den gendeletion.

Introduction

Ustilago maydis är en fytopatogena modell svamp som har studerats ingående i årtionden ^1,2. Den finns i två morfologier, en jäst-liknande, icke-patogena scen och en fintrådiga, smittsam blankett ^3. Universella genombrotts upptäckter såsom homolog rekombination och DNA-reparationsmekanismer gjordes i den jästliknande tillväxten skede av denna svamp ^4. Dessutom är den morfologiska övergång till infektions glödlampor och virulensfaktorer viktiga för infektion väl karakteriserad ^5,6. Den ökande molekyl kunskap om biologi och virulens denna smut svamp bygger på en enkel gen ersättningsstrategi ^7-9 stöds av en utmärkt genom anteckning ¹⁰ och enkel omvänd genetik att använda, till exempel, den välorganiserade plasmid samling på vårt institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardiserade, snabba infektionsanalyser i majs seedlings tillåta detaljerade studier av patogenicitet faktorer ^11.

Genomet hos U. maydis innehåller cirka 6900 gener ^10. Att studera deras funktion, kan de tas bort individuellt eller i kombination på grund av att en effektiv homolog rekombination system. Flankerande regioner av ca 1 kb innehållande perfekt homologa ändar är idealiska för hastigheter av homolog rekombination som är större än 50%, men redan 250 bp med icke-homologa ändarna tillåter en viss grad av korrekt integrering av konstruktionen ^9. För närvarande fem olika motstånds kassetter, hygR, cbxR, natR, G418 ^ och phleoR medla motstånd mot hygromycin, karboxin, nourseothricin, G418 och fleomycin, används för att selektera för transformanter ^7,9. Dessutom har hygromycinresistens utvecklats till en återvinnings kassett (FRT-hygR) som kan avlägsnas genom övergående uttryck av en heterolog FLP rekombinas ¹². Detta möjliggör avlägsnande av motstånd kassett och därmed i teorin obegränsat genetiska modifieringar. Fleomycin är mutagent ^13, så att med de nya kassetterna, i synnerhet återvinningsbart hygR kassetten, användning av phleoR minskar. Fyrdubbla mutanter kan således genereras genom användning av de andra fyra kassetter, men för quintuple mutanter, är FRT-hygR rekommenderas en ^14.

Denna allmänna strategi gendeletion har överförts till andra smuts svampar såsom Sporisorium reilianum ^15, U. hordei ^16, eller U. esculenta ¹⁷ och därmed ger möjlighet till ytterligare applikationer i ännu genetiskt svår organismer med en effektiv homolog rekombination systemet. Dessutom kan organismer som saknar homolog rekombination vara modifierad för att förbättra genteknik såsom exemplifieras av deletionen av gener som är involverade i icke-homolog-end-gå med i Neurospora crassa ^18,19.

Här beskriver vi den publicerade gendeletion strategi för U. maydis ^7,9 i experimentell detalj med fokus på snabb och noggrann kontroll av kandidaterna. Som ett exempel använder vi svamp kitinaser och skildrar generering av enstaka mutanter liksom flera radering stammar ^20,21. Kitinaser är intressanta exempel, eftersom de agerar på kitin i den styva cellväggen. Cellväggen ombyggnad krävs för morfologiska förändringar under celldelning, byta till fintrådiga tillväxt och sporbildning. Således, för deletionsmutanter fenotyper i hela livscykeln kan förväntas.

Protocol

1. Framställning av deletionskonstruktioner Generera en plasmid som innehåller deletionskonstruktionen (figur 1) innefattande en respektive 1 kb uppströms flanken (UF) och nedströms flank (DF) var och en och den lämpliga motstånd kassetten flankerad av trubbiga skärrestriktionsställen. OBS: Alla kloningsstrategi kan användas (för kloning se referens 22) vi rekommenderar Golden Gate kloning för sådana plasmider 9. Excidera rader konstruera fr?…

Representative Results

Strykningen konstruktioner för alla fyra kitinolytisk gener kodas i U. maydis genom genererades av Golden Gate kloning med hjälp av hygR kassetten för borttagning av cts1, den natR för borttagning av cts2, den G418 ^ kassett för borttagning av cts3 och cbxR för borttagning av cts4 20. En allmän översikt av genersättningsstrategi exemplifieras av strykningen av cts3 (Figur…

Discussion

Detta protokoll beskriver hur man skapar deletionsmutanter för omvända genetiska studier i U. maydis. Utgångspunkten är en deletion konstruktion som innehåller flankerande sekvenser av genen av intresse som innehåller sekvenser av ca 1 kb uppströms om starten och nedströms om stopp-kodonet samt ett lämpligt motstånd kassett som det var tidigare optimerad ^7,9 . Konstruktionerna måste vara individuellt genereras för varje gen och noggrant kontrolleras för sekvens fel innan du tar bort gene…

Materials

Aminobenzoeic acid (Free Acid)	Sigma Aldrich	A-9878
Bacto Agar	BD	214010	alternatively use local supplier
Bacto Peptone	BD	211677	alternatively use local supplier
Bacto Yeast Extract	BD	212750	alternatively use local supplier
CaCl2*2H2O	Grüssing GmbH	10234	alternatively use local supplier
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt)	Sigma Aldrich	P-2250
Carboxin	Sigma Aldrich	45371
Casamino acids	BD	223050
Cholinchlorid	Sigma Aldrich	C-1879
Citric acid	ChemSolute	24,321,000	alternatively use local supplier
CuSO4*5H2O	Fluka	61240	alternatively use local supplier
D(+)Sucrose	Roth	4621.1	alternatively use local supplier
DNA degr. free acid	Sigma-Aldrich	D-3159
EDTA	Sigma Aldrich	E4378
FeCl3*6H2O	Grüssing GmbH	10288	alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720
Trichoderma lysing enzymes	Sigma Aldrich	L1412
Glucose	Caelo	2580	alternatively use local supplier
Glycerin	Fisher Chemical	G065015	alternatively use local supplier
H3BO3	AppliChem	A2940	Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium salt	Sigma Aldrich	H3393-50KU
Hygromycin B-solution	Roth	1287.2	Dangerous substance.
KCl	VWR	26764298	alternatively use local supplier
KH2PO4	AppliChem	A3620	alternatively use local supplier
MgSO4 waterfree	Merck	7487-88-9	Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2O	AppliChem	A2087	alternatively use local supplier
myo-Inositol	Sigma Aldrich	I-5125
Na2-EDTA*2H2O	AppliChem	A2937	alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2O	Roth	0274.2	alternatively use local supplier
Na2SO4	Grüssing GmbH	12174	alternatively use local supplier
NaCl	Fisher Chemical	S316060	alternatively use local supplier
NaOH	ChemSolute	13,751,000	alternatively use local supplier
NH4NO3	Roth	K299.1	alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free Acid)	Sigma Aldrich	N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate	Werner BioAgents	5,001,000
Nutrient broth	Difco		local suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7	Sigma Aldrich	P3803	Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG)	Sigma Aldrich	P-3640
Potassium acetate	AppliChem	121479	alternatively use local supplier
Pyridoxin (Monohydrochlorid)	Sigma Aldrich	P-9755
Riboflavin	Sigma Aldrich	R4500
RNaseA	Sigma Aldrich	R5503
SDS	Roth	Cn30.3	alternatively use local supplier
small syringe	BD	300300	alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µm	VWR	28145-477	alternatively use local supplier
Sorbitol	Roth	6213.1	alternatively use local supplier
Thiamin-Hydrochloride	Serva	36020.02	alternatively use local supplier
tri-Na-Citrate	Fisher Chemical	S332060	alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane	VWR	103156X	alternatively use local supplier
Tris hydrochloride	Roth	9090.4	alternatively use local supplier
Triton X-100	Serva	37240	alternatively use local supplier
ZnCl2	Fluka	96470	alternatively use local supplier
Name	Company	Catalog Number	Comments
Composition of solutions/preparation of material			Composition of solutions
Carboxin			Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates			0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose
Geneticin (G418)			Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm)			Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal.
Heparin			Stock: 15 mg/ml
Holliday salt solution			16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution			0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
Hygromycin			Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
Nourseothricin			Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium			0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%)
RegLight			1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8			Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 8			1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG			40 % (v/v) PEG in STC-buffer
TE buffer, pH 8			1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase			10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements			0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution			12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5			806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 8			10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter.
Usti-lysis buffer 2			mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium			1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar