يعرض هذا المنشور على بروتوكول تبين كيفية قياس نشاط البروتين المؤتلف 2A الفوسفاتيز الحفاز وحدة فرعية (PP2Ac) ردا على المؤتلف α-سينوكلين، β-سينوكلين، أو البروتينات γ-سينوكلين مقايسة اللونية بسيطة باستخدام. نعرض النتائج فيما يتعلق بخصوصية α-سينوكلين نحو PP2Ac في المخ الماوس.
Α-سينوكلين (aSyn)، β-سينوكلين (بسين)، و γ-سينوكلين (جسين) هم أفراد من عائلة المصانة وصي مثل البروتينات التي يتم التعبير عن درجة عالية في الأنسجة العصبية الفقاريات. من سينوكلينس الثلاثة، قد فقط aSyn بشدة تورط في اضطرابات الأعصاب مثل مرض باركنسون، والخرف مع الهيئات ليفي، وضمور نظام متعددة. في دراسة دالة aSyn العادي، تشير البيانات إلى أن aSyn يحفز النشاط فرعية حفاز إنزيم ديفوسفوريلاتينج المعرب عنها تماما، PP2Ac في المختبر و في فيفو. وتظهر البيانات السابقة أن التجميع aSyn في دماغ الإنسان يقلل من نشاط PP2Ac في مناطق مع ليفي الهيئة علم الأمراض، حيث aSyn القابلة للذوبان قد أصبحت غير قابلة للذوبان. ومع ذلك، لكل سينوكلينس ثلاثة التماثل الكبير في سلاسل الأحماض الأمينية، صممت تجارب اختبار ما إذا كان كل ما يمكن أن تعدل النشاط PP2Ac. استخدام سينوكلينس المؤتلف والمؤتلف PP2Ac البروتين، تم تقييم النشاط بمقايسة اللونية الملكيت الأخضر. وكشفت البيانات أن جميع سينوكلينس المؤتلف ثلاثة حفز النشاط PP2Ac في فحوصات الخلية الحرة، رفع إمكانية أن التماثل المصانة بين سينوكلينس قد تضفي على جميع هومولوجس ثلاثة القدرة على ربط وتفعيل PP2Ac. ومع ذلك، توحي البيانات Co-إيمونوبريسيبيتيشن، أن يحدث PP2Ac التعديل المحتمل من خلال التفاعلات الذاتية بين aSyn و PP2Ac في فيفو.
وأفادت دراسات تحديد توزيع سينوكلينس في المخ والحبل الشوكي وتظهر أن جميع سينوكلينس الثلاث هي أثري في الأنسجة العصبية، على الرغم من أن أنماط مختلفة للتعريب وكانت1. على سبيل المثال، aSyn الأكثر وفرة في مواقع بريسينابتيك في قشرة الدماغ والعقد القاعدية32،، بسين قد توزيعاً أكثر توحيدا في المخ والحبل الشوكي4،5، وجسين أكثر وفرة في الحبل الشوكي والعقد الطرفية6. على الرغم من أن قد تحدث بعض التعبير الجنينية من جميع سينوكلينس، هومولوجس الثلاثة تصبح أكثر وفرة خلال الفترة الوليدية4،5،6،،من78. بشكل ملحوظ، البيانات من الفئران خروج المغلوب ثلاثية سينوكلين، تشير إلى أن فقدان جميع سينوكلينس ثلاثة أسباب سن بداية الخلل في الخلايا العصبية9، دعم وظائف سينوكلين الهامة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)10، 11-ولا يعرف حتى الآن إذا كانت الفئران خروج المغلوب ثلاثية سينوكلين إظهار التغييرات في توزيع PP2Ac أو النشاط. وتكشف البيانات من الفئران خروج المغلوب سينوكلين واحد أن فقدان aSyn وحدها يمكن أن تقلل إلى حد كبير النشاط PP2Ac في المخ12. بالإضافة إلى الجهاز العصبي المركزي، ترجمة جميع سينوكلينس للأنسجة الأخرى في جميع أنحاء الجسم13،،من1415.
بسبب صلاته الوراثية راسخة إلى16،نيوروديجينيريشن17، درس aSyn هي من بين الأفضل من سينوكلينس ثلاثة. المختبر بيريز عملت منذ فترة طويلة على تحديد الأنشطة الوظيفية العادية ل aSyn، لا سيما في الجهاز العصبي المركزي11،12،،من1819،،،من2021 ،من 2223 ، وفي الآونة الأخيرة في الأنسجة المحيطية24،25. ومن بين هذه، كان الاكتشاف أن aSyn يلعب دور تنظيمي رئيسي في تحفيز النشاط PP2Ac19. PP2A نشاط يساهم وظيفة المخ المعتادة، بما في ذلك لتنظيم إنتاج الدوبامين26على نطاق واسع. هولونزيمي PP2A ويتألف من ثلاث مفارز مستقلة وفرعية ج الحفاز، PP2Ac، وحدة فرعية لسقالات A وواحد من عدة مختلفة التنظيمية/استهداف ب الوحدات الفرعية التي تساعد على ترجمة PP2A إلى ميكرودومينس سوبسيلولار محددة، وبالتالي توفير PP2A 27من التنوع الوظيفي. وتبين الأدلة أن التفاعلات aSyn مع PP2Ac تسهم كثيرا في الفوسفاتيز النشاط في المختبر و في فيفو12،،من1921،23، 25. عندما يتراكم aSyn في المجاميع البروتين، كما هو الحال عند ليفي هيئات النموذج داخل الخلايا العصبية لمرض باركنسون والخرف مع الهيئات ليفي (دلب)، الأنسجة مع aSyn مجمعة تقلصت PP2Ac النشاط23،25، عندما تقلل من مستويات aSyn القابلة للذوبان. نظراً لأن جميع سينوكلينس الثلاثة قد التماثل الكبير28 (aSyn مشاركة هوية 66% مع بسين و 56 في المائة مع جسين) وأن aSyn يساهم في تفعيل PP2Ac، وأنه كان الافتراض بأن جميع أفراد الأسرة البروتين سينوكلين قد تكون قادرة على زيادة نشاط PP2Ac، على الأقل في المختبر. لتقييم هذا، وتم قياس نشاط PP2Ac ردا على aSyn المؤتلف، وبسين، وجسين استخدام مقايسة اللونية بسيطة، على غرار طريقة فتحي et al. 29-هذا الأسلوب والنتائج الرواية بالتفصيل هنا.
واستخدمت هذه المقايسة الملكيت الأخضر مع حزب العمال لقياس النشاط PP2Ac لأنه من الأسهل القيام من الأسلوب الكلاسيكي الذي يستخدم 32ف المسمى ركائز. ميزة أخرى لهذا التحليل على فحوصات المشعة هو أن خطر بعض النظائر المشعة، ويمكن أن يكون مكلفاً، لا سيما 32ف المسمى الجزيئات التي تحتوي على نصف حياة قصيرة، مما يحد من عدد فحوصات واحدة يمكن أن تؤدي قبل انتهاء صلاحية الكواشف. النفايات ف استخدام الملكيت الأخضر بدلاً من النشاط الإشعاعي أيضا يلغي الحاجة إلى التخلص من 32. فحوصات الملكيت الأخضر أيضا حساسة جداً عند قياس نشاط phosphatases سيرين/ثريونين عند مقارنتها بمقايسة اللونية آخر يستخدم الركازة فنيتروفينيلفوسفاتي (بنب)، وغير انتقائية كما يمكن أن يكون ديفوسفوريلاتيد بعدد كبير من الإنزيمات32.
مجموعات تجارية الملكيت الأخضر لقياس النشاط PP2A كانت متاحة لبعض الوقت، وكانت تستخدم سابقا في المختبر. ومع ذلك، عند القيام بفحوصات الملكيت الأخضر كثيرة، مثل مجموعات أصبحت باهظة. وبالإضافة إلى ذلك، هي مستقرة إلا لمدة سنة واحدة، في حين وجود الكواشف المتوفرة في مسحوق شكل مجموعات تجارية للنشاط PP2A ومع التخزين السليم، توفير مكونات الإنزيم متاحة بسهولة أن هيكلياً مستقرة لفترات طويلة من الزمن.
قبل إجراء الاختبار بسين وجسين، استخدمت aSyn كعنصر إيجابي لحفز النشاط PP2Ac وتحديد كمية PP2Ac المطلوبة لفحوصات، وأيضا للتأكد من أن تظل البيانات الناتجة في الجدول مع المنحنى القياسي (150-2400 pmol بو4 ). جدير بالذكر أنه إذا يحفز aSyn PP2Ac جداً بشدة، على الرغم من أن رد الفعل عادة الخطي، سوف تذهب البيانات خارج النطاق ويعجل بالمواد الكيميائية في حل مالية، مما يجعل من المستحيل على قياس كميات دقيقة من المفرج عنهم مجاناً-ص. ب.4 مع لوحة القارئ.
نظراً لأن يساهم aSyn PP2Ac النشاط في الجسم الحي وفي المختبر12،19،21،،من2325، وأن يكون جميع سينوكلينس التماثل الكبير، فقد كان الافتراض بأن جميع أفراد الأسرة سينوكلين قد تكون قادرة على حفز PP2Ac في الخلية فحوصات مجانية. باستخدام مقايسة اللونية الموصوفة هنا، واتضح أن جميع سينوكلينس ثلاث الماشوب (aSyn, بسين, جسين) في الواقع، حفز النشاط PP2Ac، وزيادة إمكانية أن جميع سينوكلينس الثلاثة قد تؤدي وظائف مماثلة في الجهاز العصبي. ولكن الدماغ من باركنسون أو العته مع ليفي الهيئة الحالات يكون أقل نشاط PP2Ac في الأنسجة التي تحتوي على درجة عالية مجمعة aSyn23. الأنسجة الماوس إيواء ليفي أيضا يحمل أمراض الجسم مثل خفض النشاط PP2Ac25. هذا، وبيانات جديدة في الشكل 3 ، فضلا عن البيانات السابقة من aSyn خروج المغلوب الفئران12، توحي بقوة أن بسين وﻻ جسين يمكن عادة التعويض عن فقدان aSyn القابلة للذوبان في الدماغ، أو بدلاً من ذلك أنه لا يجوز تلك homologs سينوكلين إقران PP2Ac بشدة باعتباره aSyn كما هو مبين (الشكل 3). أطلس الدماغ الين يظهر كولوكاليزيشن من جميع مرناس سينوكلين الثلاثة في العديد من مناطق الدماغ، وعلى الرغم من الفئران خروج المغلوب سينوكلين الثلاثي قد ولدت9،33، PP2Ac لم يتم تقييم النشاط في هذا النموذج. من المثير للاهتمام، aSyn التي يتم فوسفوريلاتيد في Ser129 بمثل بولو كيناز 2، أقل قدرة على تنشيط PP2Ac12، ولكن توحي الأدلة المعروضة هنا بسين الفسفرة بسين أن من غير المحتمل أن تؤثر على نشاط PP2Ac، كما بسين القليل جداً ونزل مع PP2Ac في المخ الماوس (الشكل 3). أخذت معا، تشير البيانات إلى أن المغيرون النشاط PP2Ac الذاتية، مثل aSyn، يحتمل المساهمة في العناية بالصحة والمرض.
البروتوكول الواردة هنا تقنية بسيطة لكنها قوية لتحديد قدرة PP2Ac على ديفوسفوريلاتي الركازة فوسفوبيبتيدي استجابة للعلاجات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذه المنهجية نفسها لاختبار المنشطات PP2Ac الأخرى، مثل سيراميد، فضلا عن إمكانية التداوي رواية34، أو لتقييم أثر PP2Ac مثبطات في المختبر. من المهم أيضا أن نشير إلى أن فحوصات مماثلة يمكن قياس نشاط PP2Ac وقد تم عزلة بواسطة 6 1 إيمونوبريسيبيتيشن من مقتطفات الخلية أو أنسجة الجسم، كما تم وصفه سابقا بالمؤلفين12،19، 25-تطبيقات المستقبل للمقايسة الملكيت الأخضر موجودة خارج قياس النشاط PP2Ac، كنشاط ATP يمكن أيضا تحديد استخدام مثل هذا فحص.
ملاحظة، يجب إنشاء منحنى قياسي في كل مرة لكل مقايسة PP2Ac المستقلة. وملزمة لضمان أن جميع الكواشف تستخدم فوسفات حرة، الفوسفات الحرة مصطنع زيادة الإشارات الخلفية وتعطي نتائج خاطئة. اليوم من الفحص الضروري لإعداد كافية حل مالية جديدة لجميع العينات تكون جزيئي. أيضا، مالية جيدة فقط اليوم بأنها مصنوعة ويميل إلى تعمد بعد بضع ساعات. PP2Ac تم شراؤها من مورد يجب أن تكون الكوتيد وتخزينها مجمدة فور تلقيه لمنع تجميد دورات ذوبان الجليد التي تحد من نشاطها. كما يمكن أن ديفوسفوريلاتي أخرى فوسفاتاسيس الركيزة حزب العمال (مثلاً PP1 و PP535)، عند تحليل مقتطفات الخلية أو الأنسجة التي لا تم عزل PP2Ac من إيمونوبريسيبيتيشن، يجب أن يتم تمرير العينات عبر الأعمدة إلى إزالة الفوسفات مجاناً ويجب أن تستخدم مثبطات محددة من فوسفاتاسيس تأكيد خصوصية الفوسفاتيز، كما هو موضح سابقا18.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب نقدر جهود أعضاء المختبر السابقة ماكيت كندرا، ساندرا سلوشير، وتشن جي الذين عملوا لتحسين الأسلوب. يشكر المؤلفون أيضا المعاهد الوطنية للصحة، مايكل ج. فوكس مؤسسة، تكساس تكنولوجيا جامعة الصحة العلوم مركز الباسو العلماء النشاط البحث المشروع (SARP)، ليزانيل ومؤسسة كولدويل كولبير، “التحالف ضمور نظام متعددة”، البحوث الأسرية هوي، وأنا مي دويل هدية الأموال من أجل تقديم الدعم المالي لهذا البحث.
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |