פרסום זה מציג פרוטוקול מציג כיצד למדוד את פעילותו של חלבון רקומביננטי פוספטאז 2A קטליטי יחידה משנית (PP2Ac) בתגובה רקומביננטי α-synuclein, β-synuclein או שימוש assay ערכי צבע מוחלטים פשוטה של חלבונים וγ-synuclein. אנו מראים הממצאים לגבי ירידה לפרטים α-synuclein לכיוון PP2Ac במוח העכבר.
Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) וγ-Synuclein (gSyn) הם בני משפחה ההכפלה של חלבונים דמויי המלווה באים לידי ביטוי במיוחד ברקמות עצביים חוליות. של synucleins שלוש, רק aSyn היה חזק מעורב הפרעות ניווניות כגון מחלת פרקינסון, דמנציה עם גופיפי, ניוון המערכת מרובים. בלימוד פונקציה aSyn נורמלי, הנתונים מצביעים על ש-asyn הזאת מעוררת את הפעילות של יחידת משנה קטליטי של אנזים dephosphorylating ביטוי בשפע, PP2Ac חוץ גופית בתוך ויוו. נתונים קודמים מראים כי צבירת aSyn במוח האנושי מפחית PP2Ac פעילות באזורים עם פתולוגיה הגוף לוי, איפה aSyn מסיסים הפך לא מסיסים. עם זאת, כי כל synucleins שלוש יש הומולוגיה ניכר רצפי חומצות אמינו, ניסויים תוכננו כדי לבדוק אם כל יכול לווסת את פעילות PP2Ac. באמצעות recombinant synucleins ו- PP2Ac חלבון רקומביננטי, פעילות הוערכה על ידי assay ערכי צבע מוחלטים מלכיט ירוק. הנתונים חשף כי כל שלוש synucleins רקומביננטי גירוי הפעילות PP2Ac מבחני ללא תאים, מעלים את האפשרות כי הומולוגיה שנשמרת בין synucleins שיעניק כל homologs שלושה עם היכולת לאגד ולהפעיל את PP2Ac. נתונים Co-immunoprecipitation, עם זאת, מציעים כי סביר PP2Ac אפנון מתרחשת דרך אנדוגני אינטראקציות בין aSyn לבין PP2Ac ויוו.
מחקרים הגדרת חלוקת synucleins המוח ואת חוט השדרה הצג את כל synucleins שלושה מועשרים ברקמות עצביות, למרות דפוסים שונים של לוקליזציה היה דיווח1. למשל, aSyn הוא הנפוץ ביותר באתרי presynaptic2,של קליפת המוח, גרעיני הבסיס-3, bSyn יש התפלגות אחידה יותר4,של המוח ואת חוט השדרה-5ו gSyn הוא יותר בשפע חוט השדרה הגרעינים היקפיים6. למרות כמה הביטוי עובריים של כל synucleins עלולה להתרחש, homologs שלוש הופכים בשפע רב יותר במהלך תקופת neonatal4,5,6,7,8. למרבה הפלא, נתונים synuclein עכברים knockout טריפל, מציינים כי אובדן של כל synucleins שלושה גורמת גיל תחילת בתפקוד עצביים9, תומך synuclein חשוב פונקציות של מערכת העצבים המרכזית (CNS)10, 11. זה עדיין לא ידוע אם עכברים knockout טריפל synuclein להציג שינויים PP2Ac הפצה או פעילות. נתונים עכברים knockout synuclein יחיד חושפים כי אובדן aSyn לבד הוא מסוגל להפחית באופן משמעותי את פעילות המוח12PP2Ac. בנוסף מערכת העצבים, synucleins כל להתאים לרקמות אחרות ברחבי הגוף13,14,15.
בגלל שלה ומבוססת גנטי קישורים הקשורים ניוון מוחיים16,17, aSyn הוא בין הטובים ביותר למד של synucleins 3. המעבדה פרז עבד זמן רב כדי להגדיר לפעילות רגילה פונקציונלי של aSyn, במיוחד ב- CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 , לאחרונה, רקמות היקפיים24,25. בין אלה, היה הגילוי הזה aSyn ממלא תפקיד הרגולציה מרכזי פעילות מגרה PP2Ac19. PP2A פעילות נרחב תורמת תפקודי מוח נורמלי, לרבות הסדרת של ייצור דופמין26. Holoenzyme PP2A מורכב שלוש subunits עצמאית, יחידת משנה קטליטי את C, PP2Ac, יחידת משנה של פיגומים א, ואחד של מספר שונה רגולטורי/מיקוד B subunits לעזור בתרגום PP2A כדי microdomains subcellular מסוים, ובכך לספק PP2A פונקציונלי27. מעידים כי aSyn אינטראקציות עם PP2Ac לתרום באופן משמעותי שלה פוספטאז הפעילות במבחנה , ויוו12,19,21,23, 25. כאשר aSyn שמצטבר אגרגטים חלבון, כפי שקורה כאשר לוי גופות טופס בתוך הנוירונים של מחלת פרקינסון, דמנציה עם גופיפי (DLB), רקמות עם aSyn צבור יש פחת PP2Ac פעילות23,25, מתי רמות של aSyn מסיסים תפחת. נתון כי כל synucleins שלוש יש הומולוגיה משמעותי28 (aSyn חולק 66% זהות עם bSyn ו- 56% עם gSyn), aSyn הזה תורם ההפעלה של PP2Ac, זה היה שיערו כי כל בני משפחת חלבונים synuclein ייתכן שניתן יהיה להגביר את פעילות PP2Ac, לפחות במבחנה. כדי להעריך את זה, PP2Ac פעילות נמדדה בתגובה aSyn רקומביננטי, bSyn ו- gSyn שימוש assay ערכי צבע מוחלטים פשוטה, על פי השיטה של פתחי. et al. 29. בשיטה זו, וכן ממצאי הרומן מפורטים במסמך זה.
זה וזמינותו מלכיט ירוק עם pT שימש למדידת פעילות PP2Ac כי זה קל יותר לביצוע מאשר השיטה הקלאסית המשתמשת 32מתויג P סובסטרטים. יתרון נוסף של assay הזה על מבחני רדיואקטיבי היא רדיואיזוטופים להוות סיכון מסוים, עשויה להיות יקרה, במיוחד 32מולקולות מתויג P זה יש חצי חייהם קצר, אשר מגביל את מספר מבחני אחד יכול לבצע לפני ריאגנטים לפוג. באמצעות מלכיט ירוק יותר מאשר רדיואקטיביות גם מבטל את הצורך להיפטר 32P פסולת. מבחני מלכיט ירוק הם גם מאוד רגיש כאשר מודדים את הפעילות של phosphatases סרין/תראונין בהשוואה assay ערכי צבע מוחלטים אחרת העושה את המצע p-nitrophenylphosphate (pNPP), וזו לא בררניים כפי שהוא יכול להיות dephosphorylated על ידי מספר רחב של אנזימים32.
קיטים מסחריים מלכיט ירוק כדי למדוד פעילות PP2A היו זמינים כבר כמה זמן, שימשו בעבר במעבדה. עם זאת, כאשר עושים מבחני מלכיט ירוק רבים, ערכות כאלה הפך יקר מדי. בנוסף, קיטים מסחריים לפעילות PP2A יציבים רק לשנה אחת, בעוד שיש ריאגנטים זמין בצורת אבקה, עם אחסון נאות, מספקים רכיבים זמינים assay יציבים מבחינה מבנית במשך פרקי זמן ארוכים.
לפני בדיקת bSyn ו- gSyn, aSyn שימש כפקד חיובי כדי לעורר פעילות PP2Ac, כדי לקבוע את כמות PP2Ac הדרושים עבור מבחני, גם כדי לוודא כי הנתונים המתקבלים יישארו על הסולם עם עקומת סטנדרטי (150-2400 pmol של פו4 ). ראוי לציין שאם aSyn מעוררת PP2Ac הנשים האלה, למרות התגובה היא בדרך כלל ליניארי, נתונים יכבה סולם, כימיקלים בפתרון ההנהלה לזרז, ואי אפשר למדוד כמויות מדויקות של חינם-פו שפורסמו4 עם צלחת הקורא.
בהתחשב בכך aSyn תורם PP2Ac פעילות בתוך vivo ו- in vitro לקשרי12,19,21,23,25, וכי כל synucleins יש הומולוגיה ניכרת, זה היה שיערו כי כל בני המשפחה synuclein עשוי להיות מסוגל לעורר PP2Ac בתוך התא מבחני חינם. באמצעות ערכי צבע מוחלטים וזמינותו המתוארת כאן, התברר כי אכן, כל synucleins רקומביננטי שלוש (aSyn, bSyn, gSyn) המרצת פעילות PP2Ac, מעלים את האפשרות כי כל synucleins שלוש עשויה לבצע פונקציות דומות במערכת העצבים. עם זאת, המוח של פרקינסון או דמנציה עם הגוף לוי מקרים יש פחות פעילות PP2Ac ברקמות המכילות מאוד המצטברים aSyn23. העכבר רקמות מחסה לוי פתולוגיה הגוף כמו גם ייתקלו צמצום פעילות PP2Ac25. ואת הנתונים החדשים באיור 3, כמו גם נתונים קודמים עכברים knockout aSyn12, ממליץ כי לא bSyn ולא gSyn יכול בדרך כלל לפצות על האובדן של aSyn מסיסים במוח, או לחלופין זה homologs synuclein האלה אולי לא לשייך PP2Ac כמו aSyn כמו שמוצג (איור 3). הרי האטלס המוח אלן מראה colocalization של mRNAs synuclein שלוש כל בתחומים רבים של המוח, למרות synuclein טריפל נוקאאוט עכברים היה שנוצר9,33, PP2Ac פעילות לא העריך במודל הזה. מעניין, aSyn זה הוא phosphorylated על Ser129 על ידי פולו דמוי קינאז 2, הוא פחות מסוגל להפעיל PP2Ac12, אבל הראיות המוצגות כאן עבור bSyn להציע את זרחון bSyn סביר לפגיעה פעילות PP2Ac, כפי bSyn מעט מאוד ירד עם PP2Ac במוח העכבר (איור 3). יחדיו, הנתונים מראים כי אנדוגני מאפננים פעילות PP2Ac, כמו aSyn, עשויה לתרום בריאות ומחלות.
פרוטוקול שמפורטות כאן היא טכניקה פשוטה אך רבת עוצמה כדי לקבוע את הקיבולת של PP2Ac כדי dephosphorylate מצע phosphopeptide בתגובה טיפולים שונים. למשל, ניתן להשתמש באותה מתודולוגיה זו לבחון אחרים מפעילים PP2Ac, כגון סרמידים, כמו גם פוטנציאל הריפוי34, או כדי להעריך את ההשפעה של PP2Ac מעכבי במבחנה. חשוב גם לציין כי מבחני דומה יכול למדוד את הפעילות של PP2Ac זה מבודד 1D 6 immunoprecipitation תמציות תאים או רקמות הגוף, כפי שצוין בעבר שתואר על ידי מחברים12,19, 25. העתיד יישומים עבור וזמינותו מלכיט ירוק קיים מעבר מדידת פעילות PP2Ac, כפי ATP פעילות ניתן גם לקבוע באמצעות כזה וזמינותו של.
שימו לב, עיקול רגיל להפיקם בכל פעם עבור כל assay PP2Ac עצמאית. זה הכרחי כדי להבטיח כי ריאגנטים כל שימוש חינם, פוספט מלחי חינם באופן מלאכותי להגדיל את האות רקע, לתוצאות שגויות ביום של וזמינותו זה חיוני כדי להכין פתרון ההנהלה טריים מספיק עבור כל דוגמאות להיות לבדיקה. גם, ההנהלה הוא רק טוב היום. זה עשוי, נוטה לזרז אחרי כמה שעות. PP2Ac נרכשה מספק חייב להיות aliquotted ומאוחסנים קפוא מיד לאחר קבלתו כדי למנוע מחזורים הפשרת ההקפאה להפחית את פעילותה. כמו אחרים phosphatases ניתן dephosphorylate המצע pT (למשל PP1 ו PP535), כאשר ניתוח תמציות תאים או רקמות שבו PP2Ac לא היה מבודד על ידי immunoprecipitation, דגימות חייבים להיות מועברים על עמודות כדי להסיר פוספטים חינם מעכבים ספציפיים של phosphatases צריך לשמש כדי לאשר ירידה לפרטים פוספטאז, כפי שתואר לעיל18.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מעריך את המאמצים על ידי חברי מעבדה מוקדמת Mackett קנדרה, סנדרה סלושר ו חן Jie שעבד לייעל את השיטה. המחברים גם מודה מכוני הבריאות הלאומיים, מייקל ג’יי פוקס קרן, טקסס טק אוניברסיטת בריאות מדעי מרכז El Paso בלווי פעילות מחקר הפרויקט (SARP), Lizanell, קולבר Coldwell קרן, הקואליציה ניוון המערכת מרובות, הוי המשפחה מחקר, אנה מיי דויל מתנה כספים עבור תמיכה כספית של מחקר זה.
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |