Questa pubblicazione presenta un protocollo che Mostra come misurare l’attività della subunità catalitica di recombinant della proteina fosfatasi 2A (PP2Ac) in risposta a ricombinante α-synuclein, β-synuclein o γ-synuclein proteine usando un semplice saggio colorimetrico. Mostriamo le conclusioni relative alla specificità di α-synuclein verso PP2Ac nel cervello del topo.
Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) e γ-Synuclein (gSyn) sono membri di una famiglia conservata di proteine chaperone-like che sono altamente espressi in tessuti di un neurone dei vertebrati. Di tre synucleins, solo aSyn è stato fortemente implicato nei disordini neurodegenerative quali il morbo di Parkinson, demenza con corpi di Lewy e atrofia del sistema multiplo. Nello studio aSyn normale funzione, i dati indicano che aSyn stimola l’attività della subunità catalitica di un enzima dephosphorylating abbondantemente espressa, PP2Ac in vitro ed in vivo. Dati precedenti indicano che aSyn aggregazione nel cervello umano riduce PP2Ac attività nelle regioni con patologia del corpo di Lewy, dove aSyn solubile è diventato insolubili. Tuttavia, poiché tutte le tre synucleins hanno una notevole omologia nelle sequenze dell’amminoacido, esperimenti sono stati progettati per verificare se tutti possono modulare l’attività di PP2Ac. Utilizzando synucleins ricombinante e proteina PP2Ac ricombinante, l’attività è stata valutata dall’analisi colorimetrica di verde malachite. I dati hanno rivelato che tutti i tre synucleins ricombinante ha stimolato attività PP2Ac nelle analisi senza cellula, sollevando la possibilità che l’omologia conservata tra synucleins può dotare tutti i tre omologhi con la capacità di legare a ed attivare il PP2Ac. Dati di co-immunoprecipitazione, tuttavia, suggeriscono che PP2Ac modulazione probabile si verifica attraverso endogene interazioni tra aSyn e PP2Ac in vivo.
Studi che definiscono la distribuzione di synucleins nel cervello e nel midollo spinale Mostra che tutti i tre synucleins sono arricchiti in tessuti neurali, anche se diversi modelli di localizzazione sono stati segnalati1. Per esempio, aSyn è più abbondante a siti presinaptici nella corteccia cerebrale e nei gangli basali2,3, bSyn ha una distribuzione più uniforme nel cervello e nel midollo spinale4,5e gSyn è più abbondante nel midollo spinale e gangli periferici6. Anche se può verificarsi qualche espressione embrionale di tutti i synucleins, i tre omologhi diventano più abbondanti durante il periodo neonatale4,5,6,7,8. Notevolmente, dati da topi synuclein triple, indicano che la perdita di tutti i tre synucleins causa età insorgenza disfunzione neuronale9, sostegno synuclein importanti funzioni nel sistema nervoso centrale (SNC)10, 11. non è ancora noto se synuclein triple topi mostrano cambiamenti nella distribuzione di PP2Ac o attività. I dati da topi knockout singolo synuclein rivelano che la perdita di aSyn da solo è in grado di ridurre significativamente l’attività PP2Ac in cervello12. Oltre al sistema nervoso centrale, tutti i synucleins si localizzano altri tessuti in tutto il corpo13,14,15.
A causa della sua consolidata collegamenti genetici a neurodegenerazione16,17, aSyn è tra i migliori studiato dei tre synucleins. Il laboratorio di Perez ha lavorato a lungo per definire normale attivita ‘ funzionale di aSyn, soprattutto a CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 e più recentemente in tessuti periferici24,25. Tra questi, è stata la scoperta che aSyn svolge un ruolo regolatore chiave in stimolante PP2Ac attività19. Attività di PP2A contribuisce ampiamente alla funzione normale del cervello, tra cui per la regolazione della produzione di dopamina26. Holoenzyme PP2A è costituito da tre subunità indipendente, la subunità catalitica di C, PP2Ac, una subunità di ponteggi A e uno di parecchie diverse normative/targeting B unità secondarie che aiutano a localizzare PP2A a specifici subcellulari, fornendo così PP2A la diversità funzionale27. La prova indica che aSyn interazioni con PP2Ac contribuiscono significativamente alla sua fosfatasi attività in vitro e in vivo12,19,21,23, 25. Quando aSyn si accumula in aggregati proteici, come avviene quando i corpi di Lewy in forma all’interno di neuroni di morbo di Parkinson e demenza con corpi di Lewy (DLB), tessuti con aggregati aSyn sonodiminuite PP2Ac attività23,25, quando i livelli di aSyn solubile diminuiscono. Dato che tutti i tre synucleins hanno omologia significativo28 (aSyn condivide identità di 66% con bSyn e 56% con gSyn) e quello aSyn contribuisce all’attivazione del PP2Ac, è stato supposto che tutti i membri della famiglia di proteine synuclein possono essere in grado di aumentare l’attività di PP2Ac, almeno in vitro. Per valutare questo, attività di PP2Ac è stata misurata in risposta a aSyn recombinante, bSyn e gSyn utilizzando un semplice saggio colorimetrico, modellato dopo il metodo di Finizio et al. 29. questo metodo e i risultati novelli sono dettagliati nel presente documento.
Questa analisi di verde malachite con pT è stata usata per misurare l’attività di PP2Ac perché è più facile da eseguire rispetto al metodo classico che utilizza 32P-etichettati substrati. Un altro vantaggio di questo test su saggi radioattivi è che radioisotopi comportano qualche rischio e possono essere costosi, soprattutto 32P-etichettati molecole che hanno emivita breve, che limita il numero di test si può eseguire prima che scadano i reagenti. Utilizzando verde malachite anziché radioattività Elimina anche la necessità di disporre di 32P rifiuti. Saggi di verde malachite sono anche molto sensibili quando si misura l’attività della fosfatasi della serina/treonina rispetto ad un altro saggio colorimetrico che utilizza il substrato p-nitrophenylphosphate (pNPP), che è non-selettivi, come può essere defosforilata da un vasto numero di enzimi32.
Verde malachite commerciale kit per misurare l’attività di PP2A sono stati disponibili per un certo tempo e in precedenza erano utilizzate in laboratorio. Tuttavia, quando si fa molti saggi di verde malachite, tale kit è diventato proibitivo. Inoltre, kit commerciali per attività di PP2A è stabile solo per un anno, mentre avendo reagenti disponibili in polvere forma e con una corretta conservazione, forniscono componenti di analisi prontamente disponibili che sono strutturalmente stabili per lunghi periodi di tempo.
Prima del test bSyn e gSyn, aSyn è stato utilizzato come controllo positivo per stimolare l’attività PP2Ac e per determinare la quantità di PP2Ac necessaria per le analisi e anche per confermare che i dati risultanti rimangono sulla scala con la curva standard (150-2400 pmol di PO4 ). È interessante nota che se aSyn stimola PP2Ac troppo fortemente, anche se la reazione è in genere lineare, dati andrà fuori scala e prodotti chimici nella soluzione MGT precipitano, rendendo impossibile per misurare gli importi precisi di rilasciato gratis-PO4 con una piastra lettore.
Dato che contribuisce aSyn PP2Ac attività in vivo e in vitro12,19,21,23,25, e che tutte le synucleins hanno una notevole omologia, era stato supposto che tutti i membri della famiglia synuclein possono essere in grado di stimolare PP2Ac nelle analisi gratuita delle cellule. Utilizzando il saggio colorimetrico descritto qui, è stato trovato che, infatti, tutti i tre synucleins ricombinante (aSyn, bSyn, gSyn) ha stimolato attività PP2Ac, sollevando la possibilità che tutti i tre synucleins possono svolgere funzioni simili nel sistema nervoso. Tuttavia, del cervello dal morbo di Parkinson o demenza con corpi di Lewy casi hanno meno attività PP2Ac in tessuti che contengono altamente aggregate aSyn23. Tessuti di topo che harboring Lewy corpo-come patologia presentano anche ridotto PP2Ac attività25. Questo, e nuovi dati nella Figura 3 nonché dati precedente da aSyn KO topi12, suggeriscono fortemente che né bSyn né gSyn in genere può compensare la perdita di aSyn solubile nel cervello, o in alternativa che quelli omologhi synuclein potrebbero non associare a PP2Ac fortemente quanto aSyn come mostrato (Figura 3). L’Atlante del cervello di Allen Mostra colocalizzazione di tutti tre synuclein mRNAs in molte aree del cervello, e però topi knockout synuclein triple sono stati generati9,33, PP2Ac attività non è stata valutata in quel modello. Interessante, aSyn che è fosforilata su Ser129 di Polo-like chinasi 2, è meno in grado di attivare PP2Ac12, ma prova qui indicata per bSyn suggeriscono che la fosforilazione bSyn è improbabile che impatto attività PP2Ac, come bSyn molto poco è venuto giù con PP2Ac nel cervello del topo (Figura 3). Presi insieme, i dati suggeriscono che i modulatori endogeni di attività PP2Ac, come aSyn, probabile contribuiscano al benessere e alla malattia.
Il protocollo descritto qui è una semplice ma potente tecnica per determinare la capacità di PP2Ac a dephosphorylate un substrato phosphopeptide in risposta ai vari trattamenti. Per esempio, questa stessa metodologia può essere utilizzata per testare altri attivatori PP2Ac, come i ceramidi, nonché potenziali approcci terapeutici34, o per valutare l’impatto di PP2Ac inibitori in vitro. È anche importante sottolineare che simili analisi possono misurare l’attività di PP2Ac che è stato isolato dai 1 6 immunoprecipitazione da estratti di cellule o tessuti del corpo, come precedentemente descritti da autori12,19, 25. esistono applicazioni di futuro per il dosaggio di verde malachite oltre misura PP2Ac attività, come attività di ATP può anche essere determinata usando un’analisi di tali.
Si noti che una curva standard deve essere generata ogni volta per ogni dosaggio PP2Ac indipendente. È obbligatorio per assicurare che tutti i reagenti utilizzati sono fosfati, come fosfati gratis artificialmente aumentano il segnale di fondo e producono risultati errati. Il giorno del test è essenziale per preparare la soluzione MGT abbastanza fresco per tutti i campioni da saggiare. Inoltre, MGT è buono solo il giorno in cui è fatto e tende a precipitare dopo poche ore. PP2Ac acquistato da un fornitore deve essere aliquotato e conservati congelati subito dopo viene ricevuto per evitare cicli di scongelamento freeze che riducono la sua attività. Come altri fosfatasi possono dephosphorylate pT substrato (ad es. PP1 e PP535), quando si analizzano gli estratti delle cellule o del tessuto in cui PP2Ac non è stato isolato mediante immunoprecipitazione, campioni devono essere passati sopra le colonne per rimuovere i fosfati gratis e specifici inibitori delle fosfatasi devono essere utilizzati per confermare la specificità della fosfatasi, come descritto in precedenza18.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori apprezzano gli sforzi dai membri di laboratorio previa Kendra Mackett, Sandra Slusher e Jie Chen che ha lavorato per ottimizzare il metodo. Gli autori ringraziano anche il National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso da studioso attività ricerca progetto (SARP), Lizanell e Colbert Coldwell Foundation, più sistema atrofia coalizione, Ricerca della famiglia Hoy e Anna Mae Doyle regalo fondi per il sostegno finanziario di questa ricerca.
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |